副豬格拉瑟菌與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的診斷和防治

田梓翰, 吳 昊, 阮勝男, 任文慧, 吳昊蔚, 何啟蓋,3

(1. 華中農業大學動物醫學院, 湖北 武漢 430000 ; 2. 華中農業大學生豬健康養殖協同創新中心, 湖北 武漢 430000 ;3. 農業農村部獸用診斷制劑創制重點實驗室, 湖北 武漢 430000)

副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)是一種革蘭陰性菌,屬巴氏桿菌科,是豬上呼吸道中的常在菌之一,在特定情況下可引起豬全身性疾病,主要表現為4～8周齡豬發生纖維素性多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎,稱為格拉瑟病(Gl?sser's disease)[1],是當前危害養豬業的一種重要的細菌性疾病。豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),也稱“藍耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種免疫抑制性和高度接觸性的傳染病。2006年以后出現的類HP-PRRSV毒株和類NADC-30毒株等表現出更強的致病力和傳播力,為防控該病帶來新的難題[2-4]。豬感染PRRSV可導致免疫細胞損傷,造成機體免疫系統障礙,使機體對其他病原更為易感[5]。臨床上常見PRRSV與致病菌混合感染情況,給養殖業帶來了嚴重的經濟損失。

本試驗對某豬場育肥豬群多種病原混合感染的案例開展綜合診斷,根據診斷結果提出用藥和防控等相關措施,并評價其防控效果,為廣大生豬養殖企業防控相關疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養基(Tryptone soy agar,TSA)和胰酪大豆胨液體培養基(Tryptone soy broth,TSB),均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司;犢牛血清,購自浙江天杭生物科技股份有限公司;氧化型輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),購自北京索萊寶科技有限公司;豬繁殖與呼吸綜合征病毒弱毒苗(R98株),購自湖南中岸生物藥業有限公司;復方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液,購自成都中牧生物藥業有限公司;5%酒石酸泰萬菌素預混劑,購自濰坊華英生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix,購自北京康為世紀生物科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix、病毒DNA/RNA提取試劑盒和HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR,均購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器 生物安全柜,海爾生物醫療有限公司產品;核酸電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;CFX Connect熒光定量PCR檢測系統和T100 PCR儀,均為美國BIO-RAD公司產品。

1.3 現場調查 調查發病豬場背景信息,觀察發病豬臨床癥狀,剖檢8頭臨床癥狀明顯的發病豬,觀察并記錄其器官病理變化。采集肺臟、脾臟、腹股溝淋巴結和心包積液,用于后續實驗室病原檢測。

1.4 實驗室診斷

1.4.1 細菌分離鑒定 無菌采集剖檢病豬的肺臟和心包積液,接種到含NAD和5%犢牛血清的TSA培養基,置于CO2恒溫培養箱,37 ℃培養24～48 h后觀察結果,挑取單個菌落進行純化培養。挑取純化后的單菌落接種到含NAD和10%犢牛血清的TSB培養基,37 ℃搖床過夜培養。吸取200 μL菌液,使用細菌基因組DNA提取試劑盒按說明書操作提取細菌DNA,并通過PCR方法檢測副豬格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)、豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)和支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)的DNA片段,PCR所用引物和序列見表1。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒核酸檢測 分別采集發病豬的腹股溝淋巴結、脾臟和肺臟組織約1 g,于2 mL EP管中剪碎,加入1 mL Hank's平衡鹽溶液進行勻漿處理。勻漿后于-80 ℃反復凍融3次,離心取組織上清液,同一頭豬的不同組織上清液合并為1份樣品,共得到8份樣品,使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取樣品DNA和RNA,并對提取的RNA樣品進行反轉錄處理得到cDNA。對得到的DNA和cDNA進行熒光定量PCR,檢測PRRSV、豬圓環病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)核酸,所用引物和探針序列見表2。所用引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 病毒檢測所用引物和探針序列

1.5 防控措施

1.5.1 治療 結合臨床癥狀、病理變化和實驗室檢測結果,綜合診斷本次疫情為副豬格拉瑟菌和PRRSV混合感染。制定的治療方案為:全群給藥酒石酸泰萬菌素(混飲,每1 L水,50～75 mg)和復方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液(肌內注射,每次20～30 mg/(kg·bw),1日1～2次,每連用3 d停藥1 d),持續給藥1周。全群給藥1周后,對A和B棟豬群接種PRRSV弱毒苗(R98株),用專用稀釋液稀釋成每頭份2 mL,肌內注射。

1.5.2 評價 豬場每天記錄轉入數、轉出數、死淘數和存欄量,計算各棟舍的周死淘率,直至豬群出欄。采用GraphPad Prism 8軟件對數據進行統計分析,使用t檢驗對各棟舍免疫前后的周死淘率進行差異顯著性檢驗,以評估該綜合防控方案對發病豬場生產成績的影響。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 現場調查 該場育肥豬來自于偽狂犬病和豬瘟凈化的繁殖場。本育肥場于2021年10月12日陸續轉入豬只(約70日齡),10月29日轉入結束,該豬群未接種PRRSV疫苗,PCV2疫苗免疫程序為14日齡首免、35日齡加強免疫。豬群轉入后,陸續出現豬只精神沉郁,食欲下降,體溫升高至41 ℃以上,畏寒扎堆,喜臥,行動不便,咳嗽和噴嚏等癥狀,部分患豬呈犬坐式呼吸;輕度腹瀉,肛周可見黃色稀糞,尿液深黃、氨味重。腹股溝和陰門等柔軟部位有藍紫色淤血斑,體表可見紅色斑疹;剖檢8頭臨床癥狀明顯的發病豬,均觀察到大葉性肺炎,肺臟腫大充血、質地變硬(圖1A),被膜下可見膠凍樣物質,肺間質明顯增寬,可見多處出血斑相連成片,胸腔纖維素性滲出、積液(圖1B);出血性淋巴結炎,腹股溝淋巴結腫大至正常豬的3～4倍(圖1C);纖維素性心外膜炎(絨毛心),心包粘連、積液(圖1D)。

2.2 實驗室診斷

2.2.1 細菌分離鑒定 TSA培養基上長出針尖大小、無色、透明、光滑、濕潤的菌落。挑取菌落提取DNA并進行PCR擴增,結果顯示,在750～1 000 bp位置可見清晰條帶,與副豬格拉瑟菌陽性對照結果一致,陰性對照對應位置未見條帶(圖2),其他細菌PCR擴增結果均為陰性,表明樣品中存在副豬格拉瑟菌。

圖2 副豬格拉瑟菌PCR擴增

2.2.2 病毒核酸檢測 提取病料核酸得到的DNA和cDNA,進行熒光定量PCR檢測,結果顯示,8份樣品均為PRRSV和PCV2核酸陽性(圖3)。

圖3 熒光定量PCR檢測PRRSV(A)和PCV2(B)

分析臨床癥狀、病理剖檢和實驗室檢測結果,結合豬群的免疫背景進行綜合診斷,最終判定本次發病為副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。實驗室檢測雖然檢測到PCV2,但考慮豬群已經按程序免疫過2次PCV2疫苗,并結合背景和臨床發病表現,故判定PCV2并非本次疾病的主要原因。

2.3 防控措施評價

2.3.1 周死淘率和存欄量 采取防控措施時,A棟豬群處于疫病暴發階段;B棟豬群開始出現少量發病豬。A和B棟豬群存欄量和周死淘率結果如圖4所示,2021年12月11日,A棟豬群突然出現大量咳嗽、喘氣和發熱的病豬,1周內豬群周死淘率急劇上升至19.85%;2021年12月16日全群投藥,1周后周死淘率下降至6.53%;隨后,2021年12月23日接種PRRSV弱毒苗,2周后周死淘率下降至1.00%左右,疫病得到有效控制(圖4A)。B棟豬群周死淘率維持在3%以下,經2022年12月16日給藥和12月23日緊急接種,直至育肥豬出欄,豬群未出現大規模病情(圖4B)。說明即使場內相鄰豬舍發生PRRS,及時進行全群給藥和接種PRRSV弱毒苗,能夠有效遏制疾病的發展,降低發病豬死淘率,減輕發病棟舍對相鄰棟舍的影響。

圖4 豬群周死淘率和存欄量

2.3.2 免疫前后周死淘率對比 A和B棟豬舍免疫前后各4周(2021年11月25日—12月23日和2021年12月23日—2022年1月20日)周死淘率對比結果如圖5所示,A棟豬群平均周死淘率由免疫前的7.74%下降至免疫后的1.57%,免疫后的周死淘率與免疫前相比具有極顯著差異(P<0.01)。B棟豬群免疫前后的平均周死淘率均維持在2.00%以下,免疫后的周死淘率與免疫前相比未見顯著差異(P>0.05),表明接種PPRSV弱毒苗有效地遏制了疾病的繼續發展。

圖5 免疫前后周死淘率對比

上述結果證明,使用復方磺胺間甲氧嘧啶鈉注射液和酒石酸泰萬菌素,并緊急接種PRRSV弱毒苗,極大降低了發病豬只死淘率,可有效控制和預防副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。

3 討論

據走訪調查,該豬場員工防疫意識淡薄,加上生豬市場行情低迷導致資金緊張,并未及時免疫相關疫苗和進行預防性用藥,導致了疾病蔓延擴大,造成了嚴重的經濟損失。各棟舍沒有嚴格執行定人定崗制度,員工在不同棟舍交叉工作;員工為了減小冬季豬舍內的晝夜溫差,降低了舍內通風量和送風頻率,豬舍內刺激性氣體濃度升高,導致豬呼吸系統損傷,從而更容易受到呼吸道病毒和病原菌的侵襲[14,15]。上述問題極大增加了疫病傳播和發生的風險。

在本試驗中,豬場在使用藥物和疫苗的同時,全面加強了飼養管理和生物安全的工作,包括阻斷人員和物資在棟舍間的流動、淘汰發病豬、及時通風和控制豬舍內的溫濕度和氨氣水平、及時清理豬欄中的糞污等措施。研究表明,泰萬菌素可以抑制PRRSV復制,縮短PRRSV病毒血癥周期,從而減輕PRRSV感染動物的臨床癥狀和減少動物病死率[16,17]。復方磺胺間甲氧嘧啶注射液具有非常高效的廣譜抗菌作用,常用于緩解豬無名高熱癥狀[18]。根據本實驗室多年來對該豬場抗菌藥敏感性監測結果,該場流行的副豬格拉瑟菌對復方磺胺間甲氧嘧啶鈉中度敏感。因此,這2種藥物被選為該豬場的常備藥物。值得注意的是,生產數據表明,接種PRRSV弱毒苗能夠有效降低豬群中PRRSV感染后的死淘率,這與先前研究中臨床免疫效果觀察一致[19,20]。酒石酸泰萬菌素和復方磺胺間甲氧嘧啶鈉的聯合用藥,停藥后配合使用PRRSV弱毒苗,進一步降低了案例豬場發病豬的死淘率,為防治副豬格拉瑟菌和PRRSV的混合感染提供了方法參考。

養殖企業應堅持“預防為主,防大于治”的原則方針,把生物安全作為疫病防控的第一道防線。謹慎引種,引種后加強檢測。嚴抓舍內衛生環境和通風換氣工作,做好豬只的越冬保暖工作。建立科學的消毒、藥品和疫苗使用制度,做好各階段豬只的保健預防工作,提高綜合防病水平[21,22];通過提高飼料的營養配比,增加微量元素和益生菌等,增強豬群整體免疫力[23,24],從而保障生產的健康有序性。