2018—2021年中國部分省份牛病毒性腹瀉病毒的流行病學調查

和彥良, 李真光, 蘇瑋瑋, 郝艷霞, 武 華, 朱國強

[1. 揚州大學獸醫學院, 江蘇 揚州 225009 ; 2. 華威特(江蘇)生物制藥有限公司, 江蘇 泰州 225300]

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種以發熱、腹瀉、消化道黏膜糜爛和壞死、流產等為主要特征的接觸性傳染病[1-3]。BVDV進入機體后可破壞機體免疫系統,誘發免疫抑制[4]。妊娠母牛感染BVDV后可引起流產、死胎、畸形,懷孕的前3個月感染BVDV,可能會導致高比例的持續感染(Persistent infection,PI)牛出生[5-7],PI牛對感染的BVDV具有免疫耐受性,可終身帶毒并排毒[8,9]。BVD自1946年在美國紐約首次被發現以來[10],已呈全球范圍內流行,造成嚴重的經濟損失[11]。1980年,李佑民等在國內首次分離得到BVDV[12],隨后該病毒在全國范圍內流行。Deng等對2010—2013年我國8個省份進行BVDV流行病學調查,BVDV抗體陽性率為78.09%,抗原陽性率為1.39%[13]。Deng等對2017—2019年我國19個省份92個奶牛場開展BVDV流行病學調查,BVDV抗原陽性率為2.22%[14]。隨著我國養牛業的飛速發展,規模化養殖場BVDV的感染更為嚴重[15,16],很大程度上影響養牛業的可持續發展。

國際上防控BVDV的措施主要有兩種,一種是篩查凈化,一種是疫苗接種。瑞典、西班牙和芬蘭等國采用篩查凈化,很好地控制了BVDV的流行;美國和德國等國則采用疫苗免疫,也取得了顯著的成效[17,18]。我國自2016年起有多家企業研制出BVDV疫苗,疫苗的安全性和有效性逐漸被廣大養殖戶認可。本試驗于2018—2021年在國內8個主要養牛省份采集了5 270份血清樣品和1 363份組織樣品,分別進行BVDV抗體和核酸檢測;同時持續性監測疫苗免疫牛群的BVDV中和抗體變化規律,旨在更新國內BVDV的流行數據,評價疫苗的免疫效果,為我國BVDV的防控提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 流行病學調查檢測樣品 2018—2021年在遼寧、吉林、河北等8個省份50個養牛集中地區的規模化養牛場采集血清樣品5 270份和組織樣品1 363份,分別用于BVDV抗體和核酸檢測,樣品采集信息見表1、2,樣品來源牛場的牛只多存在呼吸道和消化道疾病散發。

表1 2018—2021年不同省份血清樣品采集信息

表2 2018—2021年不同省份組織樣品采集信息

1.2 中和抗體檢測樣品 2018—2021年在河北、山東和河南等6個省份的BVDV疫苗接種場采集血清樣品1 449份,用于BVDV中和抗體監測,樣品采集信息見表3。牛場使用的BVDV疫苗均為BVDV1型滅活疫苗,主要有牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗(1型,NM01株)、牛病毒性腹瀉/黏膜病、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗(1型,NM01株+LN01/08株)和牛病毒性腹瀉/黏膜病、傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗(NMG株+LY株)。免疫程序牛場間存在一定差異,但多為犢牛3月齡免疫接種1次,4月齡加強接種1次,母牛配種前1個月接種1次,產前2個月接種1次,每頭牛1頭份/次。

表3 2018—2021年不同省份中和抗體檢測用血清樣品采集信息

1.3 主要試劑和細胞 BVDV熒光定量PCR檢測試劑盒,購自易瑞生物技術股份有限公司;BVDV ELISA抗體檢測試劑盒,購自IDEXX公司。牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)和BVDV1 NM01株中和抗原,均由華威特(江蘇)生物制藥有限公司提供。

1.4 主要儀器 實時熒光定量PCR儀,購自賽默飛世爾科技公司;生物安全柜,購自蘇州安泰空氣技術有限公司;二氧化碳培養箱,購自日本松下健康醫療器械株式會社;酶標儀,購自美國伯樂公司;離心機和微量移液器,購自德國艾本德(Eppendorf)有限公司。

1.5 BVDV ELISA抗體檢測 按照BVDV ELISA抗體檢測試劑盒說明書的操作步驟和判定方法進行BVDV ELISA抗體檢測。

1.6 BVDV核酸檢測 按照BVDV熒光定量PCR試劑盒說明書的操作步驟和判定方法進行BVDV核酸檢測。

1.7 BVDV中和抗體檢測 利用微量血清中和試驗進行血清中和效價(Serum neutralization titer,SN)測定。將待檢血清56 ℃滅活30 min,在96孔U型板用DMEM培養基做2倍倍比稀釋,100 μL/孔;將BVDV1 NM01株中和抗原用DMEM培養基稀釋至200 TCID50/0.1 mL,加入96孔U型板,100 μL/孔,充分混勻,置37 ℃中和1 h,依次將96孔U型板中的血清和抗原混合液移至長滿MDBK細胞的96孔細胞板,100 μL/孔,置37 ℃、5% CO2培養箱培養4 d。每天觀察細胞病變,接種后第4天進行中和抗體效價判定。

2 結果

2.1 BVDV血清學調查 采集的5 270份血清樣品中,檢出BVDV抗體陽性樣品4 131份,陽性率為78.39%。按省份劃分,河北BVDV抗體陽性率最高,為90.03%(623/692);甘肅BVDV抗體陽性率最低,為70.95%(525/740);其余省份抗體陽性率介于72.28%～85.23%(表4)。

表4 不同省份BVDV抗體檢測

2.2 BVDV流行趨勢 按時間分析,2018年、2019年、2020年和2021年調查區域牛群總體BVDV抗體陽性率分別為75.59%(1 743/2 306)、75.44%(1 189/1 576)、86.24%(733/850)和86.62%(466/538),呈上升趨勢,其中山東BVDV抗體陽性率上升趨勢明顯,甘肅BVDV抗體陽性率呈下降趨勢,其余各省份變化趨勢不規律,呈上下波動(表5和圖1)。

圖1 2018—2021年牛群總體BVDV抗體陽性率變化趨勢

2.3 BVDV核酸調查 采集1 363份組織樣品中,檢出BVDV核酸陽性樣品98份,陽性率為7.19%。按省份劃分,河北BVDV核酸陽性率最高,為20.71%(29/140);其次依次是江蘇、河南、吉林、甘肅、寧夏和遼寧;山東BVDV核酸陽性率最低,為1.17%(3/257)(表6)。按時間分析,2018年、2019年、2020年和2021年調查區域牛群總體BVDV核酸陽性率分別為5.78%(19/329)、7.96%(46/578)、3.57%(9/252)和11.76%(24/204),總體呈上升趨勢;2021年的BVDV核酸陽性率最高,超過10.00%(表7和圖2)。

表6 不同省份BVDV核酸檢測

表7 2018—2021年牛群總體BVDV核酸檢測

2.4 免疫牛群BVDV中和抗體監測 在疫苗免疫牛群采集的1 449份血清樣本中,BVDV的SN≤1∶4的比例為4.49%(65/1 449),SN介于1∶8～1∶16的比例為5.04%(73/1 449),SN介于1∶128～1∶512的比例為24.78%(359/1 449),SN≥1∶1 024的比例為65.70%(952/1 449),牛群中BVDV的SN≥1∶128的比例達到了90.48%(1 311/1 449)(表8和圖3)。按時間分析,2018年、2019年、2020年和2021年調查區域牛群整體的BVDV中和抗體效價的平均值分別為1∶938.2、1∶1 026.6、1∶1 077.6和1∶1 579.3,抗體水平呈逐年上升趨勢;免疫牛群BVDV的SN逐漸集中分布在1∶1 000～1∶2 000(圖4)。

圖3 疫苗免疫牛群BVDV中和抗體水平總體分布

表8 2018—2021年疫苗免疫牛群BVDV中和抗體效價的分布

3 討論

我國是世界第三的養牛大國,2021年牛存欄量達9 817萬頭。近年來,隨著我國規模化和集約化養牛業的快速發展,跨國家或地區的引種和調運頻繁,致使BVDV在國內的流行越來越嚴重,BVD已成為影響我國養牛業發展的重要疫病之一[19-21]。BVDV的傳播以垂直傳播和水平傳播為主,垂直傳播途徑母畜可直接將病毒傳染給胎兒;水平傳播途徑較多,如飛沫傳播、共用料槽、管理措施不當均可造成BVDV的水平傳播[22]。國內外諸多研究證明,BVDV可感染多種動物,例如牛、羊、豬、駱駝和鹿等,跨物種間的傳播增加了BVD的防控和凈化難度[23,24]。目前,我國缺乏完善的生物防范制度,BVDV的傳播未得到有效控制,總體流行范圍和感染數量呈現上升態勢。國內養牛業中規模化養殖和個體散養混雜,難以采用篩選凈化的方式防控BVDV,疫苗接種則是一種廉價、可行和有效的方法。

本試驗通過調查2018—2021年國內主要養牛地區的BVDV流行現狀,更新了BVDV在我國的流行病學數據,調查區域內牛群BVDV的抗體陽性率介于70.95%～90.03%,核酸陽性率介于1.17%～20.71%;抗體和核酸陽性率總體呈逐年上升趨勢,BVDV流行日趨嚴重,抗體陰性牛勢必會成為感染的對象。為給我國BVDV的防控提供借鑒和參考,本試驗持續性監測2018—2021年BVDV疫苗免疫牛群的BVDV中和抗體的變化規律,結果顯示,BVDV疫苗免疫牛群的BVDV中和抗體水平呈逐年上升趨勢,90.48%的牛群BVDV中和抗體效價不低于1∶128。疫苗的免疫接種在很大程度上提高了牛群的整體免疫水平,但牛群中仍有少數牛呈BVDV抗體陰性,牛場需加強牛群的免疫效果監測。本試驗通過分析國內主要養牛省份BVDV的流行現狀,結合疫苗免疫效果的持續性監測,證實疫病監測和疫苗免疫接種是當前形勢下我國BVDV防控的關鍵。