枯草芽孢桿菌細胞壁通過TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信號通路調控綿羊瘤胃上皮細胞β-防御素-1的表達

辛雅明, 白綏明, 白 剛, 高景鵬, 樊翀宇, 韓彩霞, 周 偉, 張文彥, 永 榮, 齊 盟, 肖 紅, 楊銀鳳

(1.內蒙古農業大學獸醫學院, 內蒙古 呼和浩特 010018 ; 2.鄂爾多斯市動物疫病預防控制中心, 內蒙古 鄂爾多斯 017000 ; 3. 清澗縣動物疫病預防控制中心, 陜西 榆林 718399 ; 4. 鄂爾多斯市農牧技術推廣中心水產技術站, 內蒙古 鄂爾多斯 017000)

抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一種幾乎存在于所有生物中的陽離子多肽[1]。防御素(Defensins)是AMPs中的一個大家族,除了具有抗細菌、真菌和病毒等活性外,防御素還具有趨化免疫細胞和免疫調節的作用[2],因此,近年來備受關注。β-防御素作為防御素家族中的一員,廣泛分布于人、鼠、犬、家畜(牛、羊、豬、駱駝)、野生動物(馴鹿、梅花鹿)以及家禽(雞、火雞)的多種器官上皮細胞內。綿羊β-防御素-1(Sheep-β-defesin-1,SBD-1)是綿羊體內重要的內源性抗菌肽,在綿羊氣管和整個消化道都有表達[3-5]。

益生菌是一類可以定殖在人或動物體內,并改變宿主某一部位菌群組成,對宿主有益的非致病性微生物[6]。益生菌通過多種機制發揮有益作用,包括降低腸道pH值、調節黏膜免疫反應、減少病原生物的定植和入侵、調節腸道內菌群平衡、改變宿主的免疫應答等[7]。研究表明,細菌類益生菌可以作用于上皮細胞誘導防御素的表達,從而提高家畜的抗病能力,維持胃腸道健康[8]。枯草芽孢桿菌就是一種典型的廣泛應用于畜牧業的益生菌。2014年,王佩等[9]研究發現,使用益生性枯草芽孢桿菌刺激綿羊瘤胃上皮細胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)后,SBD-1 mRNA和蛋白的表達量顯著上升,從而提高綿羊抗病能力。然而,對于枯草芽孢桿菌誘導防御素的有效成分和機制尚不清楚,有效成分及機制研究的不足必將影響益生菌的全面開發和利用,枯草芽孢桿菌細胞壁作為枯草芽孢桿菌的主要成分,其是否為誘導SBD-1產生的有效成分成為了研究者探究的問題。

枯草芽孢桿菌細胞壁的主要成分是肽聚糖 (Peptidoglycan,PG),它對細菌生存至關重要,部分抗菌藥主要通過抑制肽聚糖的合成來發揮抗菌作用[10]。枯草桿菌的細胞壁還含有少量的磷壁酸(Teichoic acid,TA),分為壁磷壁酸(Wall teichoic acid,LTA)和脂磷壁酸(Membrane teichoic acid,MTA)[11]。2021年,梁棟等[12]采用反復凍融法與超聲波破碎法相結合的方法破碎枯草芽孢桿菌并收集其細胞壁。2022年,辛雅明等[13]研究發現,枯草芽孢桿菌細胞壁可以顯著誘導SBD-1的產生,并篩選出枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs的最佳條件,由此說明枯草芽孢桿菌細胞壁是枯草芽孢桿菌誘導SBD-1表達的有效成分之一。本試驗在已經證明枯草芽孢桿菌細胞壁可以誘導ORECs SBD-1基礎上,進一步探究其誘導機制。

不同的益生菌誘導防御素表達的主要有效成分和機制不完全相同。有研究表明,瑞士乳桿菌SBT2171誘導人結直腸腺癌細胞-2(Colorectal adenocarcinoma cell-2,Caco-2)中人β-防御素-2(Human β-defensin-2,hBD-2)表達的有效成分是其表面蛋白,它是通過激活MAPKs信號傳導途徑中的C-Juk 氨基末端激酶(C-Jun kinase enzyme,JNK)來刺激hBD-2的表達[14]。釀酒酵母菌誘導綿羊瘤胃上皮細胞內SBD-1表達的主要有效成分是細胞壁組分β-葡聚糖和甘露聚糖,其中甘露聚糖誘導機制由核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路共同介導[15],而β-葡聚糖誘導機制以NF-κB信號通路為主[16]。那么,枯草芽孢桿菌細胞壁作為一種菌體有效成分,其激活的信號通路途徑是NF-κB還是MAPK,有待進一步研究。

本試驗首先制備枯草芽孢桿菌細胞壁,檢測枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs后信號通路因子mRNA和蛋白表達的變化,然后使用信號通路抑制劑阻斷各信號通路,檢測其對SBD-1 mRNA表達的影響,從而對枯草芽孢桿菌細胞壁誘導SBD-1表達機制進行探究,有助于在分子水平上揭示反芻動物胃腸道內微生態黏膜免疫機制,為飼料企業全面研發枯草芽孢桿菌相關飼料添加劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種和瘤胃組織 枯草芽孢桿菌(菌號:CMCC63501),購自中國微生物菌種網。6月齡左右綿羊瘤胃組織,取自內蒙古自治區呼和浩特市北亞屠宰場。

1.2 主要試劑 肽聚糖檢測試劑盒(SND-Q070)和磷壁酸檢測試劑盒(SND-Q090),均購自諾仕達生物科技公司;DMEM/F12培養基,購自Gibco公司;RNA提取試劑盒,購自Axygen公司;PrimeScript RT Master Mix 和TB Green Fast qPCR Mix 試劑,均購自TaKaRa公司;動物全蛋白提取試劑盒,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;NF-κB抑制劑PDTC、JNK抑制劑SP600125、p38絲裂原活性蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK)抑制劑SB202190和細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)抑制劑PD98059,均購自Sigma公司;Anti-NF-κB-antibody、Anti-p38-antibody、Anti-JNK-antibody和Anti-β-actin-antibody,均購自北京博奧森公司;Anti-ERK1/2-antibody,購自Affinity公司;Anti-TLR-2-antibody,購自Bosterbio公司;Anti-MyD88-antibody,購自SANTA CRUZ公司;電泳液、轉膜液和CCK-8(Cell counting kit-8)試劑盒,均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀,賽默飛世爾科技公司產品;多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司(BioTek)產品;電泳儀和轉膜儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司產品;OlymPus顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司產品;超聲波破碎儀(BILON),上海比朗儀器制造有限公司產品。

1.4 ORECs培養和生長曲線繪制 選取綿羊瘤胃背囊部分組織,將瘤胃組織修剪為直徑8 cm的圓形,鈍性分離肌層和漿膜層,保留黏膜層,用含有600 μg/mL青鏈霉素和20 μg/mL兩性霉素的生理鹽水多次沖洗。沖洗干凈的組織用0.25% Trypsin-0.02% EDTA消化液于37 ℃消化,共消化7次,消化時間依次為40、30、20、10、6、5和3 min。顯微鏡下觀察消化液,消化初期脫落的細胞大部分為角質細胞,僅有少量上皮細胞,均需要棄掉,消化后期在觀察到有大量圓而亮的細胞(即上皮細胞)出現時,立即收集細胞并用等體積培養基終止消化,1 500 r/min離心5 min,取細胞沉淀置于完全培養基(DMEM/F12液體培養基中添加20%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、50 μg/mL慶大霉素和100 μg/mL青霉素),培養3 d后觀察細胞貼壁和生長情況,當細胞鋪滿培養瓶面積90%后傳代,將F3代ORECs按照CCK-8試劑盒說明書繪制細胞生長曲線。將F3代細胞與50 μg/mL枯草芽孢桿菌細胞壁共培養24 h,觀察細胞活性狀態[13]。

1.5 枯草芽孢桿菌細胞壁制備和成分分析 按照梁棟等[12]的方法制備枯草芽孢桿菌細胞壁,并稱重計算細胞壁得率(細胞壁質量÷菌體質量×100%),使用酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法分析枯草芽孢桿菌細胞壁成分,分別將細胞壁溶于稀釋液中,配置為200 μg/mL肽聚糖含量待測液和500 μg/mL磷壁酸含量待測液。分別按照肽聚糖檢測試劑盒(SND-Q070)和磷壁酸檢測試劑盒(SND-Q090)說明書檢測樣品中肽聚糖和磷壁酸含量,試驗重復3次。

1.6 RNA提取和實時熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR) 枯草芽孢桿菌細胞壁與ORECs共培養,按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,將RNA濃度統一調至200 ng/μL,按照PrimeScript RT Master Mix說明書反轉錄為cDNA,將獲得的cDNA分裝保存于-80 ℃待用于RT-qPCR。特異性引物的設計和合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,引物信息如表1,RT-qPCR反應體系和反應程序均參照TB Green Fast qPCR Mix 試劑盒說明書。

表1 RT-qPCR引物信息

1.7 RT-qPCR檢測信號通路因子mRNA表達水平變化 為了探究枯草芽孢桿菌細胞壁誘導ORECs SBD-1表達的信號通路,利用RT-qPCR技術檢測刺激前后通路因子mRNA相對表達水平變化。將細胞瓶內狀態良好的ORECs傳代到6孔板中,待生長2 d細胞鋪滿整個6孔板后進行12 h的饑餓處理,將3個孔作為空白對照組,3個孔作為刺激組,空白對照組添加2 mL F12培養基(Ham's F12 nutrient medium)孵育12 h,刺激組添加2 mL濃度為50 μg/mL的枯草芽孢桿菌細胞壁作用12 h。提取各組ORECs總RNA,使用RT-qPCR技術檢測刺激前后通路因子(TLR-2、MyD88、p38、JNK、NF-κB、ERK1/2)mRNA相對表達水平的變化。

1.8 蛋白免疫印跡(Western blot,WB)檢測信號通路因子蛋白表達水平變化 利用WB技術檢測枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs前后通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK、ERK1/2)蛋白表達水平的變化。同1.7將細胞傳到6孔板,3個孔作為空白對照組,3個孔作為刺激組,作用12 h后使用動物全蛋白提取試劑盒提取ORECs總蛋白,利用BCA法測定蛋白濃度,并將蛋白濃度調整為1 μg/mL,加熱到100 ℃作用10 min使蛋白變性。電泳條件為先80 V 1 h,再120 V 1 h,轉膜條件為200 mA 90 min,轉膜后用5% 脫脂乳封閉3 h,用抗體TLR-2(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB(1∶2 000)、p38(1∶2 000)、JNK(1∶750)和ERK1/2(1∶750)4 ℃過夜孵育,洗膜后用相應的二抗孵育1.5 h,ECL顯影并使用Image J進行灰度值分析。

1.9 阻斷各信號通路對SBD-1 mRNA表達水平的影響 將ORECs傳代至12孔板,待長滿后饑餓處理12 h,按表2進行試驗分組,空白對照組不進行抑制劑前處理,不添加枯草芽孢桿菌細胞壁;陰性對照組只進行抑制劑前處理,不添加枯草芽孢桿菌細胞壁;陽性對照組只添加枯草芽孢桿菌細胞壁;試驗組進行抑制劑前處理并添加枯草芽孢桿菌細胞壁。根據試驗需要對試驗組和陰性對照組提前進行抑制劑前處理,即對細胞進行抑制劑溫育2 h;陽性對照組和試驗組添加枯草芽孢桿菌細胞壁作用12 h。利用RT-qPCR檢測各組SBD-1 mRNA相對表達水平。

表2 不同抑制劑分組

1.10 統計分析 使用GraphPad Prism 7對試驗結果進行作圖和統計學分析,試驗結果用“平均值±標準差”表示,P<0.05表示顯著差異,P<0.01表示極顯著差異。

2 結果

2.1 枯草芽孢桿菌細胞壁成分分析 枯草芽孢桿菌細胞壁冷凍干燥后經稱重計算,細胞壁得率為27.5%。肽聚糖和磷壁酸標準曲線如圖1A和圖1B所示,3份200 μg/mL肽聚糖含量待測液樣品OD值分別為0.209、0.208和0.212,根據試劑盒標準品曲線計算出含量分別為181.12、180.25和183.73 μg/mL,含量百分比分別為90.56%、90.12%和91.87%,取平均值為(90.85±0.91)%;3份500 μg/mL磷壁酸含量待測液樣品OD值分別為0.344、0.345和0.337,根據試劑盒標準品曲線計算出含量分別為44.52、44.65和43.58 μg/mL,含量百分比分別為8.90%、8.93%和8.72%,取平均值為(8.85±0.11)%(圖1C),因此,本試驗提取出的枯草芽孢桿菌細胞壁主要成分為肽聚糖和磷壁酸,含量分別為(90.85±0.91)%和(8.85±0.11)%,細胞壁各組分占比如圖1D所示。

圖1 枯草芽孢桿菌細胞壁成分檢測

2.2 ORECs培養和生長曲線繪制 原代ORECs生長2 d后貼壁(圖2A);將原代細胞傳代2次(F3)后,培養2 d后細胞生長迅速,細胞胞質清亮,邊緣清晰,狀態良好(圖2B)。F3代細胞培養8 d,每天進行細胞計數,繪制生長曲線,呈典型的“S”型(圖2C)。將F3代ORECs與50 μg/mL枯草芽孢桿菌細胞壁共培養24 h后,細胞形態大小無明顯變化,無細胞脫落現象(圖2D),與未處理正常F3代細胞(圖2B)相比,細胞狀態無明顯變化。

圖2 ORECs培養狀態觀察(40×)和生長曲線

2.3 RT-qPCR檢測各信號通路因子mRNA表達水平變化 結果如圖3所示,刺激組信號通路因子TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2 mRNA相對表達水平均極顯著高于空白對照組(P<0.01),表明枯草芽孢桿菌細胞壁誘導ORECs SBD-1表達過程中信號通路因子TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2的mRNA表達水平升高。

圖3 枯草芽孢桿菌細胞壁對ORECs內信號通路因子mRNA相對表達水平的影響

2.4 WB檢測各信號通路因子蛋白表達水平變化 結果如圖4所示,刺激組信號通路因子TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2蛋白表達水平均顯著高于空白對照組(P<0.05或P<0.01),與RT-qPCR結果相符合,表明枯草芽孢桿菌細胞壁誘導ORECs SBD-1表達過程中會激活信號通路因子TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2。

圖4 枯草芽孢桿菌細胞壁對ORECs內信號通路因子蛋白相對表達水平的影響

2.5 阻斷各信號通路對SBD-1 mRNA表達水平的影響 結果如圖5所示,試驗組的SBD-1 mRNA相對表達水平均極顯著低于陽性對照組(P<0.01),下降幅度最顯著的是經PDTC(NF-κB特異性抑制劑)和SP600125(JNK特異性抑制劑)預處理的試驗組,同時陰性對照組與空白對照組之間的SBD-1 mRNA相對表達水平無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

抗菌藥引起的耐藥菌出現和藥物殘留等問題日益嚴重,對人、動物和環境造成的危害也日益突出[17]。因此,我國從2020年開始全面“禁抗”,以維護動物源食品安全和公共衛生安全[18]。這迫使飼料企業研發能夠提高動物飼料利用率和抗病能力的飼料添加劑,而益生菌正是符合這一要求的飼料添加劑,并且可能成為反芻動物飼用抗菌藥的理想替代品[19]。但是,要想安全高效的使用益生菌制劑,首先應該充分了解益生菌的主要有效成分和其發揮作用的機理。

隨著生物科學的發展,防御素作為一種具有重要抗微生物活性的內源肽已經被用于預防和治療疾病[20]。研究表明,各種益生菌刺激物能夠通過MAPK和NF-κB信號通路介導上皮細胞中防御素的表達,這是由于MAPK和NF-κB家族成員控制著細胞因子、抗微生物效應因子的表達[21,22]。細菌細胞壁作為益生菌重要的菌體成分,在誘導防御素表達過程中發揮重要作用,且主要是通過MAPK和NF-κB信號通路誘導防御素表達。劉佳明等[23]研究表明,乳桿菌細胞壁可以通過NF-κB和MAPK中的p38通路誘導人陰道上皮細胞β-防御素的表達。

釀酒酵母細胞壁通過NF-κB和MAPK通路共同介導β-防御素的表達[24]。鼠李糖乳桿菌細胞壁主要通過NF-κB通路介導防御素的表達[25]。

辛雅明等[13]的研究已經證明,枯草芽孢桿菌細胞壁可以誘導SBD-1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高。本試驗先從mRNA和蛋白水平檢測使用枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs后TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK、ERK1/2表達水平的變化,以探索枯草芽孢桿菌細胞壁誘導SBD-1表達過程中激活的通路因子,結果顯示,刺激后這些通路因子mRNA和蛋白表達水平均顯著升高,表明枯草芽孢桿菌細胞壁誘導ORECs SBD-1表達與MAPK和NF-κB信號通路有關。為了進一步判定參與SBD-1表達的主要信號通路,本試驗使用了添加抑制劑處理的方法,結果顯示,經抑制劑處理后再用枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs,細胞中SBD-1 mRNA表達水平極顯著下降,而下降幅度最顯著的是經PDTC(NF-κB特異性抑制劑)和SP600125(JNK特異性抑制劑)預處理的試驗組,此結果進一步表明了枯草芽孢桿菌細胞壁刺激ORECs誘導SBD-1表達的主要信號通路可能為TLR-2-MyD88-NF-κB和TLR-2-MyD88-JNK。

王佩等[9]研究證明,枯草芽孢桿菌活菌誘導ORECsSBD-1 mRNA的表達主要通過MAPK信號通路中的p38信號通路。趙霏霏等[26]研究表明,枯草芽孢桿菌滅活菌誘導ORECsSBD-1 mRNA的表達通過TLR-2-MyD88-MAPKs(p38、JNK、和 ERK1/2)信號通路介導,并且ERK1/2 信號通路是主要轉導途徑。本試驗證明,枯草芽孢桿菌細胞壁作為枯草芽孢桿菌的菌體成分,其誘導SBD-1表達與NF-κB信號通路相關,且枯草芽孢桿菌細胞壁誘導SBD-1 mRNA的表達主要通過TLR-2-MyD88-NF-κB和TLR-2-MyD88-JNK信號通路。

韓超等[27]研究指出,枯草芽孢桿菌細胞壁主要成分是肽聚糖,還有少量的磷壁酸。本試驗提取出的枯草芽孢桿菌細胞壁成分中肽聚糖含量為(90.85±0.91)%,磷壁酸含量為(8.85±0.11)%,此結果與上述報道基本一致。有研究指出,肽聚糖作為細胞壁的重要組成成分,具有誘導防御素表達的作用,如鼠李糖乳桿菌肽聚糖可以顯著誘導禽β-防御素-9的產生[28]。磷壁酸雖然在細胞壁中占比較少,但其在免疫調節中發揮重要作用,例如,植物乳桿菌磷壁酸可以激活細胞膜受體TLR-2,從而激活ERK信號通路,調節機體炎癥反應[29]。本試驗發現,枯草芽孢桿菌細胞壁可以激活NF-κB和MAPK(JNK、ERK1/2、p38)信號通路,是肽聚糖或磷壁酸發揮作用還是二者協同發揮作用尚需進一步研究探索。

本試驗有利于枯草芽孢桿菌的進一步開發利用,將枯草芽孢桿菌菌體組分作為一種飼料添加劑添加到飼料中可以提高家畜抗病能力,推動養殖業發展。本試驗結果不僅為解釋枯草芽孢桿菌細胞壁促免疫功能提供了新線索,而且對理解益生菌與防御素之間,以及益生菌與胃腸道上皮細胞之間的關系提供了參考。然而,體外單一的直接刺激ORECs很難模擬綿羊體內復雜的調控機制,下一步試驗將會檢測枯草芽孢桿菌細胞壁是否在綿羊體內經過一系列機體調控,進而顯著誘導SBD-1基因的表達,增強動物的抗感染能力。