高效液相色譜串聯質譜法快速檢測淫羊藿藥材中47 種農藥殘留

章會瓊，楊 琴，蒲 雪，劉明容

（四川省樂山市中醫醫院，四川 樂山 614000）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉，主產于貴州、湖北、四川、遼寧、陜西、湖南（湘西）等地［1-2］。其藥用成分主要為黃酮類成分［3］，且該藥具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等功效［4-6］。目前對淫羊藿的主要研究方向為成分［7］、藥用機理［8］等方面，農藥殘留方面鮮有報道。隨著環境變化及濫用農藥現象的增加，中藥材中農藥殘留的檢測越來越受到重視［9］。李剛等［10］建立了檢測丹參中33 種農藥殘留的液相/氣相色譜串聯質譜法，與2020 年版《中國藥典（一部）》［11］中的檢測方法相比，提高了處理效率、靈敏度及準確性；倪興婷等［12］研究了人參中9 種有機氯農藥殘留，所建立的方法具有快速、準確、高效等特點；顧夢影等［13］研究了鐵皮石斛中精甲霜靈和嘧菌酯的殘留。目前，中藥材中農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法［14］、氣相色譜-質譜聯用法［15］、液相色譜-質譜聯用法［16］、毛細管電泳法［17］、拉曼光譜法［18］等，其中2種聯用法因具有高通量及定性能力強、靈敏度高的特點逐漸成為檢測農藥殘留的普遍選擇。2020 年版《中國藥典（一部）》對普通藥材中農藥殘留的檢測給出了3種指導性檢測方法、5種前處理方法，需結合不同的藥材及不同的農藥殘留合理選擇。基于此，本研究中建立了快速檢測淫羊藿藥材中47種農藥殘留的高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法，以期為其生產與質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ME104E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500型液質聯用儀（美國AB SCIEX公司）；NP-30S型渦旋混合儀（常州宇瑞儀器制造有限公司）；HT190R 型高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；H15S 型臺式微量高速離心機（四川蜀科儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC - 12A 型氮吹儀（北京佳航博創科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品信息見表1（共47批，規格均為100μg/mL；*購自壇墨質檢科技股份有限公司，其余均購自農業部環境保護科研監測所）；N- 丙基乙二胺（PSA，批號為0G010010），十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，批號為K12S22CUMX），石墨化炭黑（GCB，批號為S0257723），均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈為色譜純，甲酸、冰醋酸、無水硫酸鎂為優級純。淫羊藿藥材樣品信息見表2（共25 批，其中批號220501，220610，211201 樣品分別為巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、毛淫羊藿，其余樣品均為淫羊藿）。

表1 對照品信息Tab.1 Information of references

表2 樣品信息Tab.2 Information of samples

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×3.9 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時10%A →40%A，10～20 min時40%A →100%A，20～25 min 時100%A，25～27 min時100%A →10%A，27～32 min 時10%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為10μL。

質譜條件：掃描模式為多反應監測（MRM）模式；電噴霧離子源正離子模式（ESI+），霧化氣溫度為450 ℃，氣簾氣壓力為30 psi，碰撞氣壓力為5 psi，離子源電壓為4 500 V，輔助氣1，2 壓力均為30 psi。各農藥保留時間及質譜參數見表3。47種農藥的總離子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms

表3 各農藥保留時間及質譜參數Tab.3 Retention time and mass spectrum parameters of pesticides

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密吸取47種對照品各1 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈定容，搖勻，得質量濃度均為10μg/mL 的單一對照品溶液，4 ℃貯藏；根據單一對照品溶液響應值的高低，用乙腈依次稀釋成不同質量濃度的中間液，4 ℃貯藏。

供試品溶液：取藥材樣品粉末（過3 號篩）2 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯離心管中，加1%乙酸溶液15 mL，渦旋使之充分浸潤；加入4顆玻璃質子球和乙腈15 mL，超聲（功率150 W、頻率40 kHz，下同）5 min，劇烈手搖3 min，加入無水硫酸鎂6 g、醋酸鈉1.5 g，密塞，劇烈手搖3 min后，冰浴冷卻5 min，期間輕搖2次，8 000 r/min離心5 min；取上清液1.5 mL置凈化管內（內含無水硫酸鎂150 mg、C1850 mg、PSA 50 mg、GCB 7.5 mg），渦旋使之充分混勻、手搖2 min 使之充分凈化，10 000 r/min 離心2 min，取上清液，過有機相微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：按2.2項下供試品溶液制備方法制得空白溶液，依次加入單一對照品溶液，制得質量濃度依次為2，4，6，8，10，20 ng/ mL 的系列混合工作溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，以各待測成分的質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程和線性范圍。結果表明，47 種農藥質量濃度在2～20 ng/mL 范圍內與峰面積線性關系良好（r＞0.997）。

檢測限考察：用空白溶液稀釋單一對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積；以信噪比（S/N）為3時對應的待測成分質量分數為檢測限，結果檢測限介于0.04～6.50μg/kg，靈敏度較高。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下試驗條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果47 種待測成分峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取空白溶液適量，加入單一對照品溶液，依法制得供試品溶液Ⅰ，分別于室溫下放置0，8，16，24，36，48 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD均小于4.0%（n= 6），表明供試品溶液Ⅰ室溫下放置48 h內基本穩定。

加樣回收試驗：取空白溶液適量，加入混合對照品溶液，依法制得質量分數分別為0.05，0.1，0.5 mg/kg 的工作液，均按2.1 項下試驗條件平行測定6 次，取平均值，結果3 種質量分數下的加樣回收率分別為72.23%～89.28%，77.54%～94.82%，82.03%～96.33%，RSD分別為2.47%～4.88%，2.68%～4.79%，1.47%～4.77%（n=6）。

基質效應考察：公式為ME（%）=（A1-A2）/A2×100%（式中，A1為空白基質配標的峰面積，A2為純溶劑配標的峰面積），僅當ME 在± 20%之間可忽略［19］。結果47 種農藥基質效應介于- 69%～49%，其中40 種農藥存在負的基質效應（即基質抑制農藥的檢測靈敏度），且38 種農藥的基質效應不可忽略，因此，試驗中采用空白基質配標抵消基質效應，以提高結果的準確度。

2.4 樣品檢測

取25批藥材樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，結果10批藥材樣品中共檢出4種農藥，其中批號200401檢出多菌靈（17.2μg/kg），批號211110檢出多菌靈（14.5μg/kg）、噻蟲嗪（35.2μg/kg），批號220401 檢出多菌靈（21.8 μg / kg），批號210809檢出多菌靈（20.9 μg/ kg），批號220310 檢出甲胺磷（10.2μg/kg），批號190701檢出甲胺磷（24.7μg/kg），批號211101 檢出噻蟲嗪（22.2μg/kg），批號220303 檢出克百威（92.8 μg/ kg），批號211001 檢出克百威（17.8μg/kg），批號220701檢出克百威（110.4μg/kg）。可能原因為種植人員未嚴格規范使用農藥，也可能是土壤污染導致。檢測結果顯示，農藥的使用有一定地域性，且淫羊藿中農藥殘留的種類已從10 多年前的有機氯類農藥演變為現在的有機磷和氨基甲酸酯類農藥［20］。

3 討論

對于淫羊藿藥材，當前大多數研究僅限于少數幾個農藥殘留的同時測定，且多為有機氯類農藥的測定，對于大多數為高等或中等毒性的有機磷農藥殘留的同時測定報道較少。與傳統的氣相色譜法、液相色譜法比較，本研究中所建HPLC - MS/ MS 法進一步提高了檢測方法的準確性和靈敏度，有高通量特性，大幅縮短了分析周期，節約了檢測成本，可用于同時檢測淫羊藿藥材中47種農藥殘留。

中藥材農藥檢測的樣品制備方法包括乙腈直接提取法、QuEChERS法、乙腈提取-固相萃取柱法。預試驗中，向使用3 種不同方法制備的供試品溶液中加入0.05 mg/kg 水平的47 種農藥對照品溶液（其他預試驗同此加入水平），結果加樣回收率達標（標準為70%～110%，下同）的分別有28，40，33種。

乙腈直接提取法加樣回收率達標的農藥個數較少（氯吡脲、氟蟲脲加樣回收率在50%以下），可能原因為，溶液酸堿度不固定，對酸堿較敏感的農藥可能會分解；以及樣品雜質較多，方法除雜不徹底，造成基質效應較大，對某些農藥回收影響較大。乙腈提取- 固相萃取柱法，加樣回收率達標的農藥個數也較少，可能原因為固相萃取柱對淫羊藿藥材中基質去除較多，從而減少了基質對農藥回收率的影響。因此，本研究中選取QuEChERS 法為淫羊藿農藥檢測的樣品制備方法。

中藥材農藥檢測常用的凈化試劑包括無水硫酸鎂、PSA、C18、硅膠、GCB。預試驗中向陰性樣品中加入0.05 mg/ kg 水平的47 種農藥對照品溶液，結果PSA、C18加入量均為10，30，50，70，90 mg 時47 種農藥加樣回收率達標個數分別為37，42，44，41，37 個。兩者加入量均為50 mg時47種農藥加樣回收率達標個數最多，加入量≥70 mg 時，溶液顏色逐漸變淺，加樣回收率達標農藥個數稍有下降，這可能與PSA、C18粉末與羥基、氨基、巰基等官能團及脂溶性農藥的吸附有一定關系。同時分別考察硅膠的加入量為0，10，30，50，70，90 mg；GCB的加入量為0，5，10，15，20，30 mg時47種農藥的加樣回收率達標的農藥個數始終不多，且隨加入量的增加呈下降趨勢，可能是硅膠對47 種農藥無差別的物理吸附導致，隨著硅膠量的增加，加樣回收率下降。去掉硅膠，其他條件保持不變，當不加GCB 時，空白溶液中干擾峰較多，整體基線明顯上升，隨著GCB 量的增加，干擾峰減少，基線整體明顯下降，加樣回收率達標農藥個數在5，10 mg 時較高，在10 mg 時，基線整體較低。綜合加樣回收率達標情況和基線整體水平，選擇GCB 添加量為10 mg。綜上所述，凈化試劑最終選擇為無水硫酸鎂150 mg、PSA 50 mg、C1850 mg、GCB 10 mg。

基質效應是影響農藥殘留檢測結果準確性和重復性的重要因素［21］，在液相色譜質譜聯用方面，基質效應主要來自樣品中雜質和農藥在離子化階段競爭離子化過程，或某些雜質與農藥形成離子對，導致檢測信號增強或減弱現象。本研究中涉及的大多數農藥的基質效應為負值，故試驗中采用空白基質配標的方法消除基質效應帶來的影響，提高了試驗的準確度。本研究的不足之處在于考察的殘留農藥種數較少，后續將進一步擴大農藥的種類，為淫羊藿藥材中農藥殘留檢測的全覆蓋提供參考。

綜上所述，本研究中對25 批來自不同地區的淫羊藿藥材進行檢測，其中10 批檢出4 種農藥（多菌靈、噻蟲嗪、克百威、甲胺磷）殘留，且發現農藥的使用呈現地域性，農藥殘留的種類也已從10 多年前的有機氯類農藥（國家已禁止生產和銷售）演變為現在的有機磷和氨基甲酸酯類農藥。當前市場上使用最廣、用量最大的為有機磷農藥，本研究為有機磷農藥在淫羊藿藥材種植過程中的使用情況提供了一定的檢測數據，也為相關部門的監管和檢測提供了方向。