金蓮花軟膠囊質量標準提升研究*

林鳳屏，翁 嘉，陳霞飛，李錦妹，歐陽珠

（惠州市食品藥品檢驗所，廣東 惠州 516003）

金蓮花軟膠囊由金蓮花單味藥材經煎煮、干燥、粉碎、制粒而成，有抗菌消炎作用，主要用于治療上呼吸道感染、牙周炎、腮腺炎、口腔潰瘍、手足口病，為兒科常用藥，具有副作用小、療效確切的優點。有研究表明，金蓮花軟膠囊可抑制人冠狀病毒OC43 復制及病毒感染引起的宿主細胞相關因子的高表達［1-3］。該制劑現行標準為原國家食品藥品監督管理局標準（標準號YBZ02792008，YBZ30232005 - 2010Z）。前一標準中收載了金蓮花藥材的理化鑒別、薄層色譜（TLC）鑒別及蘆丁含量的測定方法（紫外- 可見分光光度法），后一標準中收載了金蓮花藥材的TLC 鑒別及槲皮素含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，但此2 種標準內容與2020 年版《中國藥典（一部）》金蓮花制劑（包括口服液、片、膠囊、顆粒、潤喉片）相比專屬性不強。鑒于此，本研究中參考2020 年版《中國藥典》及相關文獻［4-11］對金蓮花軟膠囊質量標準的提升進行探討。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC - 20A 型 及Agilent 1260 型高效 液 相色譜儀（日本Shimadzu 公司及美國Agilent 公司，均配置二極管陣列檢測器）；XS205型及XS204型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度分別為0.01 mg，0.1 mg）；Camag Peprostar 3 型薄層成像系統（瑞士Camag 公司）；KQ - 250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

金蓮花軟膠囊樣品10批（A廠，批號分別為L17K061，L17C061，L17L161，L18C051，L18B281，L18A111，L17A131；B 廠，批號分別為170408，170904，180108）；葒草苷對照品（批號為111777-201302，含量≥98%），牡荊苷對照品（批號為111687-200602，含量≥98%），金蓮花對照藥材（批號為121089 - 201204），均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

取樣品內容物1.5 g，混勻，加80%乙醇25 mL，超聲（功率250 W、頻率40 kHz，下同）處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，即得供試品溶液。取葒草苷、牡荊苷對照品各適量，分別加甲醇制成每1 mL含葒草苷0.6 mg、牡荊苷0.3 mg的單一對照品溶液。取金蓮花對照藥材0.5 g，加80%乙醇15 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。按金蓮花軟膠囊處方及工藝制備缺金蓮花藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。吸取上述溶液各1μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水（12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和單一對照品溶液色譜相應位置顯相同的熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1-3.供試品溶液 4.陰性對照品溶液 5.對照藥材溶液6.葒草苷對照品溶液 7.牡荊苷對照品溶液圖1 薄層色譜圖1 - 3.Test solution 4.Negative reference solution 5.Reference medicinal solution 6.Orientin reference solution 7.Vitexin reference solutionFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇- 乙腈- 0.1%磷酸水溶液（10∶12∶78，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：349 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取葒草苷對照品10 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻；精密吸取2 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得對照品溶液。將10粒樣品內容物混勻，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理20 min，放冷至室溫，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液及2.1 項下陰性對照品溶液各10 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖2。

1.葒草苷A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.OrientinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：取葒草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制得不同質量濃度的系列對照品溶液；各取10μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以葒草苷質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=25.699X+8.276 2（R2=0.999 9）。結果表明，葒草苷質量濃度在1.68～168.97 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2.2項下對照品溶液10μL，按2.2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品（批號為L17K061）溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.70%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為L17K061）適量，精密稱定，共6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果葒草苷的平均含量為4.21 mg/ g，RSD為0.60%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量（4.211 mg/ g）的樣品（批號為L17K061）6份，每份約0.125 g，精密稱定，分別加入葒草苷對照品溶液（質量濃度為0.165 45 mg/mL）3 mL，按2.2.2項下方法制備供試品溶液（從“精密加入甲醇50 mL”起），按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of orientin in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 薄層色譜

預試驗中考察了不同展開劑，包括乙酸丁酯- 甲酸-水（7∶2.5∶2.5，V/V/V）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（1∶8∶1∶1，V/V/V/V）的上層溶液、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（7∶3∶4，V/V/V）、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（8∶6∶1∶1.5及12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V），根據試驗結果及考慮減少有毒有害試劑的使用，確定展開系統為乙酸乙酯- 丁酮- 甲酸- 水（12∶6∶1∶1.5，V/V/V/V）。同時對不同廠家（德國Merck公司，青島海洋化工廠，煙臺市化學工業研究所）的薄層板、不同試驗溫度（4 ℃和40 ℃）和相對濕度（32%和88%）進行考察，結果表明，不同板材及溫度、濕度變化對色譜效果無影響，表明本方法耐用性良好。

3.2 含量測定

金蓮花軟膠囊抗菌主要有效成分為黃酮類化合物，包括葒草苷、牡荊苷、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、金蓮花苷等成分［12-14］。現行標準中缺少對金蓮花藥材有效成分的定量研究，無法更好地滿足該制劑的質量控制要求。本研究中采用HPLC 法測定金蓮花軟膠囊中葒草苷的含量，方法簡便，專屬性強，重復性好。另外，預試驗中還對不同流速（0.9 mL / min 和1.1 mL/ min）、不同柱溫（30 ℃和40 ℃）及不同色譜柱進行了考察，結果三者小幅變動對測定結果無影響，表明所建立的測定方法耐用性良好，可用于金蓮花軟膠囊的含量測定。