復方甲硝唑陰道栓檢驗方法探索性研究*

牛龍青，張秉華，衷紅梅，杜亞俊，周志云

（陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065）

復方甲硝唑陰道栓適用于治療滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、細菌性陰道炎和老年性陰道炎、非特異性陰道炎及支原體感染、淋病雙球菌感染等疾病。不良反應主要表現為胃腸道不適、中樞神經系統異常、過敏反應等。當前該藥有國內批準文號3 個，生產廠家2 家，規格為0.45 g 或3 g。現行的《美國藥典》《日本藥局方》及《中國藥典》均收載甲硝唑原料，但均未收載復方甲硝唑陰道栓，各企業均執行原國家食品藥品監督管理局國家藥品標準［WS - 1001 -（HD - 1483）- 2003］（下文簡稱《標準》），但其自2003 年批準后至今（截至發稿時）無任何增、修訂，已不能滿足嚴格控制藥品質量的要求。本研究中按此標準對復方甲硝唑陰道栓樣品進行檢驗，評價該產品的質量現狀，并針對發現的問題開展探索性研究，從有效性、安全性角度提出完善制劑質量控制標準的建議。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

LC-2030 3D型高效液相色譜（HPLC）儀、UV2600型紫外- 可見分光光度（UV）計（日本Shimadzu 公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XPE205 型及ME204 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg 或0.1 mg）；RC1208D 型溶出度儀（天津市天大天發科技有限公司）；MINI-Q IQ 7000 型高純水機（美國Millipore 公司）；TOMY SX-500 型臥式矩形壓力蒸汽滅菌器（上海華成醫用核子儀器公司）；MJ-250-11型霉菌培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；BX53 型電子顯微鏡（日本Olympus 公司）；pH 酸度計（賽多利斯科技＜北京＞有限公司）。

1.2 試藥

7批復方甲硝唑陰道栓樣品，均為2022年國家抽驗樣品，涉及2家生產企業（企業1有3批，企業2有4批），均未提供原輔料；甲硝唑原料藥共5 批，分別來自5 家企業；2-甲基-5-硝基咪唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100191-20180，含量100.0%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］，白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］，黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均來自中國醫學細菌菌種保藏管理中心。

2 方法與結果

2.1 法定檢驗

依據前述《標準》，主要檢驗項目包括性狀、鑒別、質（重）量差異、融變時限、微生物限度和含量測定。結果7批樣品各項目檢測結果均合格。

2.2 探索性研究

2.2.1 有關物質檢測方法建立

參考文獻［1-3］，經預試驗考察優化，確定樣品有關物質測定條件為，色譜柱為Welch Ultimate XB - C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇- 水（20∶80，V/V）；流速為1.0 mL/ min；檢測波長為315 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20μL。測定樣品含量時［4-5］，將上述條件中檢測波長改為320 nm，進樣量改為10 μL，其余色譜條件不變。依法制備待測溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄典型色譜圖，詳見圖1和圖2。

A.樣品 B.原料藥圖1 甲硝唑有關物質典型色譜圖A.Samples B.APIsFig.1 Typical chromatograms of metronidazole - related substances

1.2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑圖2 對照品溶液高效液相色譜圖1.2 - Methyl - 5 - nitroimidazoleFig.2 HPLC chromatograms of reference solution

按2020 年版《中國藥典（二部）》甲硝唑限度要求，對樣品進行有關物質雜質分析，發現7批樣品均檢出甲硝唑已知雜質（2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑），同時檢出個別其他單個雜質。2 - 甲基- 5 - 硝基咪唑按外標法計算，檢出范圍為0.002%～0.007%；其他單個最大雜質檢出范圍為0.002 6%～0.039%，雜質總量檢出范圍為0.004%～0.05%。各企業樣品已知雜質、其他單個最大雜質和雜質總量分布較均勻，雜質水平無明顯差異。企業1的3批樣品有關物質考察結果顯示，總雜質含量稍偏大，其中1批樣品有關物質雜質考察結果出現離散現象，提示該生產企業的生產工藝可能存在潛在風險。

2.2.2 體外釋放試驗

根據原國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心（CDE）《局部作用常見陰道制劑（陰道片、陰道栓）仿制藥的評價技術要求（意見通知稿）》（簡稱《技術要求》），參考文獻［6-9］，建立樣品釋放度考察方法，選擇2 種方法對樣品開展體外釋放試驗研究。2 種介質的制備均采用籃法（栓劑專用溶出籃），取乙酸鈉1.22 g，加水溶解，然后加入2 mol/L冰醋酸溶液20.5 mL，用水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得pH 4.0醋酸鹽緩沖溶液（介質1）；稱取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/ L 氫氧化鈉溶液15.2 mL，用水稀釋至100 mL，搖勻，即得pH 6.5 磷酸鹽緩沖溶液（介質2）。取介質1，2 各900 mL，轉速均為100 r/min，分別模擬正常陰道pH 及疾病狀態pH。不同介質下樣品的釋放曲線見圖3。

A.介質1 B.介質2圖3 不同介質下樣品的釋放曲線A.Medium 1 B.Medium 2Fig.3 Release profiles of samples under different media

可知，企業1 在2 種介質中的釋放度均優于企業2樣品。其中，企業1樣品在介質1環境下，8 h及24 h平均釋放度分別為27%，52%，在介質2 環境下分別為35%和65%；企業2的4批樣品在介質1環境下分別為7%和15%，介質2 環境下分別為6%和12%（按藥典要求保留有效值，下同）。考慮到人體胃部和陰道環境差異較大，陰道體液量較少且蠕動幅度和頻率也遠不如胃部，在轉速100 r/ min 條件下，2 家企業樣品釋放度仍明顯過低。

此外，還用3 種固體制劑體外釋放模型［10-11］對樣品釋放度的考察結果進行了數學模型擬合［12-13］，擬合結果見表1。可見，不同批次樣品用不同釋放模型擬合的結果基本一致，Weibull 分布和Riger-Peppas 方程擬合結果較好，R2多在0.99左右。

表1 樣品釋放度擬合結果Tab.1 Results of release rate fitting of samples

2.3 微生物限度檢查方法適用性試驗

依據2020 年版《中國藥典（四部）》附錄“微生物限度檢查標準”要求，樣品的微生物檢驗指標為需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，采用中和- 薄膜過濾- 分膜法，檢驗不同廠家樣品兩指標的回收比，公式為，回收比=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數，比值在0.5～2.0范圍內即為方法有效。控制菌栓劑為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌［14-16］。采用中和培養基稀釋法進行了控制菌檢查方法適用性試驗，分別設立試驗組、陽性組和陰性組，革蘭染色鏡檢，前兩組均應檢出3 種控制菌，陰性組應無任何菌落生長。

結果所有供試品中，需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數均符合規定，均未檢出大腸埃希菌。

2.4 含量測定

采用建立的HPLC 法和《標準》中的UV 法分別測定各批樣品含量，結果含量均值分別為99.8%和99.5%，基本一致。

3 討論

3.1 雜質來源

將樣品的檢出雜質與5 家甲硝唑原料生產企業的原料有關物質考察結果進行比較，發現雜質種類、個數基本一致，說明樣品生產過程中基本不會引入其他工藝雜質。根據《技術要求》，應重點研究制劑的降解產物，包括原料藥的降解產物或原料藥與輔料和/或內包材的反應產物，分析原料藥降解途徑，結合樣品有關物質的考察結果，2家生產企業均檢出已知雜質2-甲基-5-硝基咪唑和其他單個雜質，建議2 家生產企業對樣品的有關物質進行控制，以更好地控制制劑質量。

3.2 釋放度考察

試驗中發現，2 家生產企業樣品的釋放度均過低。Riger-Peppas 方程可用來描述固體制劑藥物的釋放機制，公式中釋放指數（n）是表征釋放機制的特征參數，當n≤0.45 時，為Fick 擴散；當0.45 ＜n＜0.89 時，藥物釋放機制為non-Fick擴散（Anomalous Transport），即為骨架溶蝕與藥物擴散共同控制的釋藥機制；當n≥0.89時，為骨架溶蝕機制。樣品用Riger-Peppas 方程擬合，各批次樣品釋放指數均在≥0.45～＜0.89 范圍內，擬合結果表明，樣品屬骨架溶蝕與藥物擴散共同控制的釋藥機制。

3.3 含量測定方法考察

本研究中測定樣品含量時發現，采用HPLC 法測定的同一生產企業樣品含量結果誤差范圍較大，分析原因可能是該法既是物質的分離方式，也是物質的檢測方式，其實際上是先將不同物質分離，然后將分離的單一物質進行紫外光譜檢測分析，因此其靈敏度更高，試驗結果干擾更小。此外，本研究中發現2 種方法測得的生產企業1 的樣品含量結果均高于生產企業2，且前者2 種方法測定結果的誤差范圍均小于后者，這與前者釋放度均優于后者的考察結果一致，均提示生產企業2工藝生產可能存在一定問題。

3.4 小結

陰道炎是婦科常見的炎性反應疾病，其臨床表現為陰道瘙癢、白帶異常、泌尿系統刺激征。患者如不能得到及時有效的治療，可加重病情，影響生殖功能。年輕和更年期婦女陰道上皮薄，細胞內糖原減少和雌激素缺乏，陰道pH 約為7，抵抗力較弱，易造成感染。復方甲硝唑陰道栓可提高患者陰道壁的彈性，對陰道細胞有良好的保護作用，其主要成分甲硝唑能有效抑制細菌，殺死滴蟲。老年陰道炎患者雌激素水平及陰道黏膜彈性下降，使用復方甲硝唑陰道栓治療，既能治療陰道炎，又能降低不良反應發生率，具有較高的應用價值。

復方甲硝唑陰道栓是我國治療陰道炎特有的復方制劑，研究發現，影響制劑質量的因素主要有以下幾方面：一是原料藥質量（有關物質），原料藥中雜質的量直接決定制劑中雜質的量；二是處方與生產工藝關系到制劑的釋放（溶出）情況。藥物的吸收取決于藥物從制劑中的溶出或釋放、在生理條件下的溶解及在作用部位的滲透，而藥物的溶出和溶解對吸收具有重要影響。釋放度是活性藥物成分在規定條件下從制劑中溶出的速率和程度，其可考察藥品批間質量的一致性，并提示可能的體內生物利用度問題，考察結果顯示，2家生產企業樣品的釋放度均嚴重過低，且存在較大的批間差異和批內差異，反映出2家生產企業生產工藝均存在不同程度的問題。

綜上所述，目前復方甲硝唑陰道栓總體質量較好，但國內2 家生產企業樣品均存在不同程度的生產工藝問題，建議生產企業對復方甲硝唑陰道栓的處方進行更深入的研究，確定更合理的處方工藝，特別是對樣品體內生物利用度進行進一步考察。此外，該制劑為復方制劑，但現行標準僅對甲硝唑含量等進行了相關控制，建議提高質量標準，進一步提高藥品質量。