黃芩素對黃藥子致肝損傷模型小鼠的防護作用及其機制*

朱舒虹，任翠翠，王 冉，段石頑，謝允東

（1.陜西省西安市第一醫院，陜西 西安 710002； 2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬黃獨Dioscorea bulbiferaL.的地下塊莖，在我國分布廣泛，藥用歷史悠久［1-2］。黃藥子及其制劑用于治療甲狀腺腫大、腫瘤等效果較好，但會引發肝損傷等不良反應［3］。研究發現，肝損傷主要是由二萜內酯類化合物在肝臟蓄積誘發氧化應激反應導致［4-5］。核因子E2 相關因子2（Nrf2）在肝臟組織中高度表達，在氧化應激的作用下，Nrf2 被激活，通過抗炎、抗氧化和調控細胞凋亡等機制，抑制核因子-κB（NF-κB）的激活，是肝損傷防護作用中重要的內源性抗氧化信號通路［6］；且其下游的藥物轉運體表達上調，加速肝臟中的藥物及其代謝物的轉運排泄。中藥黃芩具有保肝作用，與黃藥子配伍能減輕后者的肝毒性［7］。黃芩素是黃芩的主要活性成分，對四氯化碳、半乳糖胺、對乙酰氨基酚、卡介苗+ 脂多糖等誘導的肝損傷具有防護作用。基于此，本研究中探討了黃芩素對黃藥子致肝損傷模型小鼠的防護作用及其機制，為黃芩配伍黃藥子的臨床安全應用提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥及動物

儀器：DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器廠）；ELX-800 型酶標儀（美國Bio Tek 公司）；EXICYCLER 96 型熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司）；DP73型顯微鏡拍照系統（日本Olympus公司）。

試藥：黃芩素（批號為E0804550250，含量≥98%）、水飛薊素（批號為D110160，含量≥98%），均購自安耐吉＜上海＞醫藥化學有限公司；黃藥子飲片（陜西興盛德藥業有限責任公司，批號為20210610）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號為20211012），丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號為20211112），堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號為20211212），總膽紅素（TBiL）試劑盒（批號為20211216），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20211016），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號為20211112），谷 胱 甘 肽（GSH）試 劑 盒（批 號 為20211116），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20211218），均購自南京建成生物工程研究所；Nrf2 抗體（批號為WL012135），核 因 子（NF）- κB p65 抗 體（批 號 為WL01273b），磷酸化NF - κB p65（p - NF - κB p65）抗體（批號為WL012169），血紅素加氧酶1（HO - 1）抗體（批號為WL02400），腫瘤壞死因子- α（TNF - α）抗體（批號為WL01581），白細胞介素6（IL-6）抗體（批號為WL02841），β-actin 細胞抗體（批號為WL01372），組蛋白H3 抗體（Histone H3）抗體（批號為WL0984），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（二抗，批號為WL023），全蛋白提取試劑盒（批號為WLA019），核蛋白和漿蛋白提取試劑盒（批號為WLA020a），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號為WLA004），BeyoRT ⅡM - MLV反轉錄酶（批號為D7160L），均購自沈陽萬類生物科技有限公司；蘇木素（H，批號為H8070）、伊紅（E，批號為A600190），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

動物：健康SPF 級KM 小鼠60 只，雄性，體質量（20±2）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物合格證號0043206，實驗動物生產許可證號SCXK（川）022 - 030。動物實驗經陜西中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號SUCMDL20220304009），實驗動物使用許可證號SYXK（陜）2017-004。飼養于陜西中醫藥大學SPF 級實驗室中，相對濕度45%～65%，溫度22～24 ℃，12 h/12 h明暗交替。

1.2 方法

黃藥子醇提物制備：取藥材飲片樣品細粉適量，加10倍體積的75%乙醇加熱回流提取3次，每次4 h，合并3 次提取液，減壓濃縮蒸干，得到固體，用研缽研勻，備用。

分組、建模與給藥：將60 只KM 小鼠隨機分為正常對照組［A組，等體積0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液］，模型組（B 組，等體積0.5%CMC-Na 溶液），水飛薊素組（C 組，200 mg/ kg），黃芩素高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，10，5，2.5 mg/kg），各10 只。灌胃黃藥子醇提物（3 g/kg），每日上午1 次，連續14 d，以復制肝損傷小鼠模型，同期（每日下午）各組小鼠灌胃相應藥物或0.5%CMC-Na 溶液。末次給藥結束后，禁食不禁飲12 h。

1.3 觀察指標

體質量、肝臟質量與肝臟系數：稱定小鼠體質量。眼眶取血后，取肝臟組織，置生理鹽水中去除血塊及結締組織等，用吸水紙吸干表面的水分，稱定肝臟質量。計算肝臟系數（肝臟質量與體質量的比值）。

肝臟組織病理檢查：取小鼠肝臟組織，剪取一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，3 d 后進行石蠟包埋、切片及HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

生化指標：眼眶取血，4 ℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液。采用試劑盒說明書方法分別測定肝功能指標AST，ALT，ALP，TBiL 水平及抗氧化指標SOD，CAT，GSH，MDA水平。

Nrf2蛋白調控的下游藥物轉運體mRNA水平：取小鼠肝臟組織，加入TRIpure 裂解液，充分混勻，室溫靜置5 min，加入氯仿，混勻，室溫靜置3 min，取水相，加入等量異丙醇，-20 ℃下過夜，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇，4 080 r/min 離心3 min，棄上清，加入RNase-free 雙蒸水，室溫放置2 min，充分混勻，待沉淀完全溶解，得樣本總RNA，采用紫外-可見分光光度法測定RNA 濃度。采用反轉錄聚合酶鏈反應將樣本總RNA 反轉錄為cDNA，加入Nrf2蛋白調控的下游藥物轉運體多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）、P-糖蛋白（P-gp）、膽酸鹽外排泵（BSEP）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（UGT1A1）基因引物，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測上述基因的mRNA水平。

蛋白表達水平：采用Western blot法。取小鼠肝臟組織，液氮研磨，加入蛋白裂解液，研成勻漿，冰上靜置5 min，4 ℃、12 000 r / min 離心10 min，分離蛋白質抽提物。采用BCA 法進行蛋白質定量，經SDS - PAGE，轉膜，封閉，用5%脫脂奶粉稀釋p - NF - κB p65，NF-κB p65，TNF-α，IL-6，Nrf2，HO-1等一抗，稀釋比例為1∶500，4 ℃下孵育過夜，浸入TBST 緩沖液中，用5%脫脂奶粉稀釋二抗，稀釋比例為1∶5 000，37 ℃下孵育45 min，采用電化學發光法在暗室中顯影，掃描膠片，分析目標條帶的光密度值；同時提取細胞核Nrf2（Nuc-Nrf2）蛋白，同時測定光密度值。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析，結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；繪制柱狀圖。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、肝臟質量及肝臟系數

與A 組比較，B 組小鼠體質量顯著降低，肝臟質量與肝臟系數均顯著升高（P＜0.05）。與B 組比較，C 組、D1組小鼠肝臟質量均顯著降低，C 組、D1組、D2組、D3組小鼠的肝臟系數均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1。

a.體質量 b.肝臟質量 c.肝臟系數注：與A組比較，#P ＜0.05；與B組比較，*P ＜0.05。圖3至圖6同。圖1 小鼠的體質量、肝臟質量、肝臟系數（±s，n=10）a.Body mass b.Liver mass c.Liver coefficientNote：Compared with those in the group A，#P ＜0.05.Compared with those in the group B，*P ＜0.05（for Fig.1 and Fig.3 - 6）.Fig.1 Body mass，liver mass and liver coefficient of mice（±s，n=10）

2.2 肝臟組織病理形態

A 組小鼠的肝細胞排列整齊，邊界清晰，細胞形態與結構正常；B組小鼠肝細胞結構紊亂，邊緣模糊，界限不清，出現水腫及炎性因子浸潤，部分肝細胞核出現溶解；C 組小鼠肝細胞損傷得到好轉；D1組、D2組、D3組小鼠的肝細胞形態與結構有好轉，且隨著劑量的增加，改善作用明顯增強。詳見圖2。

圖2 小鼠肝臟組織病理形態（HE，×400）Fig.2 Pathological morphology of liver tissue of mice（HE，× 400）

2.3 肝功能指標

與A 組比較，B 組小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組小鼠的AST，ALT，TBiL 水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3。

a.AST b.ALT c.TBiL d.ALP圖3 小鼠肝功能指標（±s，n=10）a.AST b.ALT c.TBiL d.ALPFig.3 Liver function indexes of mice（±s，n=10）

2.4 抗氧化指標

與A組比較，B組小鼠的MDA水平顯著升高，SOD，CAT，GSH 水平均顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組、D1組小鼠的MDA 水平顯著降低，C 組、D1組、D2組小鼠的SOD，CAT 水平均顯著升高，D3組小鼠的SOD 水平顯著升高（P＜0.05）。詳見圖4。

a.SOD b.CAT c.GSH d.MDA圖4 小鼠抗氧化指標（±s，n=10）a.SOD b.CAT c.GSH d.MDAFig.4 Antioxidant indexes of mice（±s，n=10）

2.5 Nrf2 下游藥物轉運體mRNA 水平

與A 組 比較，B 組 小鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組 小 鼠 的MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA均顯著升高（P＜0.05）。詳見圖5。

a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1圖5 小鼠Nrf2下游藥物轉運體mRNA水平（±s，n=10）a.MRP2 b.P-gp c.BSEP d.UGT1A1Fig.5 mRNA levels of Nrf2 downstream drug transporters of mice（±s，n=10）

2.6 蛋白質表達水平

與A組比較，B組小鼠的細胞核Nrf2，HO-1蛋白的表達水平均顯著降低，p-NF-κB p65，TNF-α，IL-6蛋白的相對表達水平均顯著升高；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組小鼠前2種蛋白的表達水平均顯著升高，后3種蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖6。

3 討論

黃芩素是黃芩發揮保肝作用的有效成分，屬黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化和抗炎作用，對四氯化碳、半乳糖胺、對乙酰氨基酚及卡介苗加脂多糖所致肝損傷具有顯著的防護作用。本研究中，黃芩素干預后，細胞核Nrf2表達上調，NF-κB p65磷酸化過程被抑制，提示黃芩素可激活Nrf2/NF - κB 通路，啟動其下游的相關抗氧化蛋白的表達，抑制相關炎性因子的表達。Nrf2/ NF - κB 信號通路是肝損傷防護的有效途徑［8-10］。本研究中，B 組小鼠的細胞核Nrf2 蛋白表達水平，SOD，CAT，GSH 水平均顯著低于A 組，MDA 水平，p - NF - κB p65，TNF - α，IL - 6 蛋白表達水平均顯著高于A組，提示黃藥子誘導的肝損傷模型小鼠發生了嚴重的氧化應激反應和炎性反應。B 組小鼠肝細胞中，Nrf2 蛋白調控的下游藥物轉運體MRP2，P - gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 表達水平均顯著低于A 組，提示肝損傷模型小鼠轉運黃藥子提取物及其代謝物的量相對減少，易產生藥物蓄積損傷肝臟。

本研究中，與B 組比較，D1組、D2組、D3組小鼠的SOD，CAT，GSH 水平均顯著升高，MDA 水平顯著降低，TNF- α 和IL- 6 蛋白表達水平均顯著降低，提示黃芩素對黃藥子誘導的氧化應激與炎性反應具有改善作用。本研究中，黃芩素干預后，D1組、D2組、D3組小鼠的細胞核Nrf2 蛋白表達顯著下調，肝細胞中藥物轉運體MRP2，P-gp，BSEP，UGT1A1 mRNA 水平均顯著升高；且Nrf2 蛋白激活后誘導下游的轉運體轉錄，對于減輕藥物性肝損傷具有重要作用［11-16］，提示黃芩素對黃藥子誘導的小鼠肝損傷具有防護作用可能與激活Nrf2/ NF - κB 信號通路及其下游的藥物轉運體有關。AST，ALT，ALP，TBiL 是臨床診斷肝功能損傷的常用指標［17］。B 組小鼠的AST，ALT，TBiL 指標較A 組顯著均升高，提示B 組小鼠肝臟細胞出現了損傷壞死；D1組、D2組、D3組小鼠的上述指標水平均顯著低于B 組，提示黃芩素能改善小鼠肝損傷。該檢測結果與肝臟組織病理形態觀察結果相符。

綜上所述，黃芩素對黃藥子誘導的肝損傷有一定防護作用，其作用機制可能與通過Nrf2/NF - κB 信號通路，激活其下游的轉運體及提高抗氧化、抗炎水平有關。