個體化新生抗原疫苗治療微衛星穩定型晚期結直腸癌1例

單娜，俞耀軍，林李淼，蔡振寨

1.紹興市人民醫院 消化內科，浙江 紹興 312000；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325000；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 消化內科，浙江 溫州 325000

以腫瘤新生抗原為靶點的免疫治療因其腫瘤特異性和免疫原性強、安全性高而被認為是腫瘤免疫治療的最優靶點。我們之前的研究探索了基于腫瘤新生抗原的疫苗療法在小鼠結直腸癌模型中的可行性和有效性[1]，但此類疫苗在人類結直腸癌中尚未見應用。為進一步拓展新生抗原疫苗對晚期微衛星穩定（microsatellite stability, MSS）型結直腸癌（colorectal cancer, CRC）的治療作用，本研究為1例晚期MSS型CRC患者制備并注射了新生抗原疫苗，研究的初步結果證明了基于腫瘤新生抗原疫苗的可行性及安全性。

1 病例資料

1.1 病史及一般資料 患者，男，40歲，既往體健。2010年3月10日于上海行“結腸癌根治術”，術后病理提示：乙狀結腸潰瘍型中分化腺癌，侵及全層，周圍淋巴結見癌轉移（5/18），術后因個人原因未進行輔助化療及定期隨訪。2013年復查發現肝、肺轉移性腫瘤，隨后于揚州武警醫院行肝肺轉移瘤微波消融術。2019年至溫州醫科大學附屬第二醫院行肝、肺穿刺檢查，病理免疫組化結果均提示符合結腸癌轉移，基因檢測提示未測得用藥靶點，后接受兩次肺轉移瘤微波消融術及一次肝轉移瘤微波消融術。2019年12月開始接受新生抗原疫苗治療。本研究涉及人體樣本，相應的設計、方案和修改均獲得溫州醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會的批準（編號：LCKY2018-67）。

1.2 腫瘤新生抗原疫苗制備及注射 使用All-Prep DNA/RNA微型試劑盒（Qiagen, USA/Illumina,USA）從術后腫瘤組織的石蠟切片及外周靜脈血中提取DNA和RNA，完成全外顯子組DNA和RNA測序。基于MuPeXI（V1.2.0）[2]、NetMHCpan 4.0和變異效應預測器（variant effect predictor, VEP）數據庫[3]對DNA突變和人類白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）進行整合分析，根據HLA結合親和力、表達水平、與自身肽的相似性和突變等位基因頻 率[4-6]，對每個肽進行優先級評分。具有高優先級得分的候選新生抗原將最終被選擇用于合成疫苗。

疫苗為27個氨基酸組成的長多肽，以入選的新生抗原突變點為中心，突變點前后各增加13個氨基酸[7-8]。采用標準固相合成肽的原理合成新生抗原多肽，多肽的純化和純度分析采用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC）。疫苗的質檢包括細菌內毒素、真菌D葡聚糖檢測、細菌真菌涂片檢查及小鼠異常毒性檢測。

擬于患者治療第1、第4、第8、第15和第22天接受疫苗基礎階段注射，在第12周和第20周接受疫苗加強階段注射。具體方法為：將疫苗與聚肌胞注射液（廣東南國藥業有限公司）1:1混勻，在雙側腋下和腹股溝行皮下注射治療，每次按照逆時針順序完成4個部位的皮下注射。

1.3 安全性評估 使用國家癌癥研究所不良事件共同術語標準（4.0版）進行評分，通過評估臨床不良事件的發生率來評估疫苗治療安全性。患者疫苗注射前后的常規血指標變化也作為安全性評價的客觀依據。

1.4 臨床監測及干擾素-γ（i n t e r f e r o n gamma, IFN-γ）酶聯免疫斑點（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot）檢測 在新生抗原疫苗治療前后進行臨床腫瘤標記物監測。每兩個月進行一次增強CT檢查，以確定是否存在可測量的腫瘤轉移灶。在完成基礎階段及加強階段的注射治療后，利用IFN-γ ELISPOT試劑盒（深圳達科為生物科技有限公司）檢測新生抗原特異性T細胞中的IFN-γ，評估新生抗原的免疫反應。

1.5 本例患者疫苗治療的可行性及安全性評估結果 患者于2019年12月至2020年7月完成了8次疫苗注射治療（見圖1）。治療及隨訪期間，患者癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）指標降至正常范圍并維持11個月（見圖2），胸部增強CT顯示肺部多發轉移灶進展較前控制（見圖3）。ELISpot結果顯示，新生抗原疫苗治療后的外周單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）對新生抗原的應答活性顯著增強（見圖4）。

圖1 患者治療和臨床隨訪圖

圖2 CEA監測圖

圖3 肺部轉移瘤胸部增強CT圖像

圖4 疫苗治療免疫反應監測圖

疫苗治療期間未觀察到明顯的治療相關不良事件，常規血檢查也未發現明顯異常。

2 討論

經全外顯子組測序分析，該患者共測得508個突變肽，根據評分系統其中有246個突變肽被認定為新生抗原，最終有7個新生抗原被選定用于疫苗的合成。患者入組后共接受8次疫苗治療，在新生抗原疫苗接種期間未觀察到明顯的不良事件，并且沒有因毒性作用而延遲給藥。在觀察期間，患者CEA指標降至正常范圍并維持11個月，胸部增強CT顯示肺部多發轉移灶進展較前控制。通過監測外周靜脈血中的PBMCs，發現疫苗治療后機體產生了較強的免疫反應。截至臨床試驗截止日期，患者的無進展生存期（progression-free survival, PFS）已達24個月。上述結果的分析表明，即使是MSS型晚期CRC患者也有望從這種免疫療法中獲益。

目前，我國CRC的發病率在全身惡性腫瘤中居第五位[9]，約20%的CRC首次就診時已是IV期，其5年生存率僅為13%[10-12]。CRC晚期確診率高、晚期生存率低已成為不容忽視的現狀。由于錯失最佳手術機會、放化療方案單一、可用的靶向藥物不多等因素使得晚期CRC患者經常面臨“無藥可醫”的困境。2013年，腫瘤的免疫治療被Science雜志評為年度十大科學突破之首[13]。目前，基于免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的免疫療法已廣泛應用于肺癌、轉移性黑色素瘤、食管癌等腫瘤的治療[14-16]。Keynote-177隨機III期臨床試驗表明，使用帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療微衛星不穩定型（microsatellite instabilityhigh,MSI-H）轉移性CRC患者的PFS優于化療，同時影像學評價也顯示帕博利珠單抗組的總緩解率和完全緩解率較高[17]。這有力地證明了基于ICIs的免疫療法在MSI-H型轉移性CRC治療中的臨床價值。2015年和2016年，美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）發表了程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1）抑制劑帕博利珠單抗和納武單抗（nivolumab）治療晚期CRC的臨床試驗結果。結果表明MSI-H型CRC患者客觀緩解率優良，緩解時間較長，藥物不良反應可控。然而，占絕大多數MSS型的晚期患者很難從ICIs免疫治療中獲益[18]。因此，破除MSS型晚期CRC患者的免疫抵抗或提出新的免疫治療方法，成為了CRC免疫治療研究的熱點。

基于新生抗原的腫瘤疫苗已被證明是治療黑色素瘤和晚期肺癌的安全有效的疫苗[8，19]。相關研究表示基于腫瘤新生抗原的疫苗會觸發特異性T細胞對疫苗接種前未檢測到的預測新表位的反應，這也有力地證明了存在利用自身免疫系統殺死腫瘤細胞的可能性[20]。目前，一些臨床試驗已經證明了這些疫苗的安全性和有效性[21]。然而，關于晚期CRC腫瘤個體化疫苗治療的研究很少。課題組前期將個體化新生抗原疫苗注射到結腸癌小鼠模型體內，初步驗證了新生抗原鑒定的可行性、治療的安全性和有效性[1]。本研究為1例MSS型晚期CRC患者進行新生抗原疫苗治療，評估了腫瘤疫苗治療晚期CRC的可行性和安全性，為結直腸癌患者的免疫治療提供了新的思路。初步結果表明，新生抗原疫苗是一種安全可行的MSS型CRC治療策略。

然而，我們的臨床試驗入組患者數量少，且未能進行多中心臨床試驗，對新生抗原疫苗有效性的評估仍欠完善，這些問題都需要投入更多的時間和精力去解決。