甲基轉移酶樣因子3在結腸癌中高表達并促進結腸癌細胞惡性表型

項益嵐，胡淵博，黃婷婷，陳謝滔，陳琛斌，盧明東

1.溫州醫科大學附屬第一醫院 放射科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學 微生物學與免疫學教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035

結腸癌是全球第三大常見的惡性腫瘤，也是腫瘤相關死亡的第二大原因[1]。流行病學統計顯示2020年我國結腸癌新發病例達56萬[2]。手術切除是目前結腸癌治療的最主要手段，隨著治療方式及技術不斷改進，早期結腸癌患者的生存率有所提高。但大多數結腸癌患者在被確診時已是中晚期并已發生局部轉移，無論是術后化療，或者免疫療法的效果并不理想，其五年生存率不足15%[3-5]。因此，挖掘結腸癌發生發展的生物標志物，并進一步探索結腸癌惡性進展的分子機制，對于結腸癌防治具有重要意義。

N6-腺苷酸甲基化（N6 adenylate methylation,m6A）修飾作為最常見的RNA表觀遺傳學修飾之一，近年來被發現參與多種人類疾病的進展[6-7]。而甲基轉移酶樣因子3（methyltransferase-like 3,METTL3），作為最主要的m6A甲基轉移酶，參與食管癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤的進展[8-11]。一方面，METTL3通過調控m6A甲基化修飾參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲以及耐藥等生物學過程[12]。另一方面，METTL3還能以非m6A依賴途徑結合真核細胞啟動因子（eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A）調控mRNA翻譯效率，促進腫瘤的惡性進展[13]。然而，關于METTL3在結腸癌的表達情況及其對結腸癌細胞惡性表型的調控作用鮮有報道。本研究通過公共數據庫和溫州醫科大學附屬第一醫院結腸癌臨床樣本檢測METTL3在結腸癌中的表達水平，并在細胞水平評估METTL3對結腸癌細胞生物學表型的影響，旨在為臨床結腸癌的防控提供新的指導。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及組織標本：人結腸癌細胞DLD-1 和HCT-116均購自中國科學院細胞庫，分別使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM培養基和RPMI-1640培養基培養，并置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中。

1.1.2 試劑：胎牛血清、DEME培養基、RPMI-1640培養基均購自美國Gibco公司。METTL3兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司，GAPDH兔多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司。Western blot相關試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。CCK-8試劑購自上海翌圣生物科技股份有限公司；Transwell小室購自廣州潔特生物有限公司；基質膠購自美國BD生物科技有限公司。靶向METTL3的小干擾RNA由廣州銳博生物技術有限公司設計合成，序列為：si-NC：5’-GGCTCTAGAAAAGCCTATGC-3’；si-METTL3-001：5’-CAAGTATGTTCACTATGAA-3’；si-METTL3-002：5’-GCAAGTATGTTCACTATGA-3’。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：收集2014—2018年在溫州醫科大學附屬第一醫院接受結腸腺癌根治術的癌組織和癌旁正常組織（距離癌灶至少5 cm范圍的組織）。納入標準：患者年齡＞18周歲，接受結腸腺癌根治性手術治療，術后病理學檢查確診為結腸癌，同意參加此項研究者；排除標準：患者接受新輔助化療，拒絕接受根治性手術治療，或合并其他惡性腫瘤或嚴重的器質性疾病。最終，共納入481例結腸腺癌組織和59例癌旁組織。本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準（2021R092）。

1.2.2 生物信息學分析：使用cBioPortal數據庫（https://www.cbioportal.org/）分析METTL3在泛癌中的突變情況、三維結構、單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNPs）以及拷貝數變異（copy number variation, CNVs）情況。下載TGCA數據庫中結腸腺癌的mRNA表達數據和臨床病理特征。使用GEOquery包從GEO數據庫下載GSE17536、GSE17537、GSE29621、GSE39582中結腸癌患者基因芯片表達數據及相應患者對應的臨床病理特征和預后信息。分析METTL3基因在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達差異，及其與患者總生存率（overall survival, OS）和無病生存期（diseasefree survival, DFS）的關系。

1.2.3 免疫組化：所有手術切除的結腸腺癌組織石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，抗原修復，封閉，使用METTL3抗體室溫孵育2 h后滴加DAKO免疫組化專用二抗，37 ℃孵育1 h。經DAB顯色和蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，浸入磷酸鹽緩沖液中反藍，脫水，封片。顯微鏡下觀察并拍攝目的蛋白表達情況，使用Image-Pro Plus圖像軟件進行陽性細胞半定量分析。

1.2.4 Western blot實驗：細胞轉染siRNA后48 h，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白。通過SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉40 min，再用相應的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，最后使用顯影液于曝光機下顯色。

1.2.5 CCK-8 細胞增殖實驗：將結腸癌細胞系以 4 000個/孔的密度接種于96孔板中，12 h后進行轉染處理。待轉染1、2、3 d后，加入CCK-8試劑孵育 3 h，并使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度。在減去空白組數值調零后，比較各組增殖情況。

1.2.6 Transwell細胞遷移及侵襲實驗：將細胞按一定密度接種于六孔板內，待細胞貼壁后轉染處理，轉染24 h后將細胞消化后用無血清培養基重懸，按1×105/孔加入到Transwell上室，下室加入含10% FBS的完全培養基；其中，侵襲實驗需要在實驗開始前將基質膠稀釋后鋪于Transwell上室內。在細胞培養箱中孵育24～48 h后取出，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，洗凈后拭去上室內殘余未穿過的細胞，于顯微鏡下觀察并拍攝成功穿過的細胞并計數。

1.3 統計學處理方法 使用Graphpad Prism 8.0和R4.0.2進行數據分析。計量資料以表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。計數資料以例和百分數表示，2組間比較采用χ2檢驗，2組間等級資料的比較采用秩和檢驗。使用pROC包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線以評估METTL3基因的表達對于區分結腸腺癌和癌旁組織的診斷準確性。使用survminer包確定結腸腺癌組織中METTL3表達的最佳截斷值，進而將患者分成高表達組和低表達組；采用Kaplan-Meier生存曲線分析2組患者之間的生存差異，采用Log-rank檢驗評估2組患者生存時間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M E T T L 3 在結腸癌組織中的表達特征 cBioPortal數據庫分析結果提示，METTL3在腫瘤組織中存在一定的SNPs或CNVs變異，整體在6%以內（見圖1A、圖1B）。TCGA數據庫33種不同腫瘤的表達譜分析結果顯示，METTL3在絕大多數癌組織中表達顯著上調（見圖1C）。在TCGA數據庫結腸癌組織中，METTL3表達顯著上調（P＜0.001，見圖2A），且其表達顯著高于配對的癌旁正常組織（P＜0.001，見圖2B）；同時，其表達狀態能有效區分結腸癌和正常組織（AUC=0.921，見圖2C）。為了進一步驗證這一現象，我們通過免疫組化法檢測了396例結腸癌組織和48例癌旁正常組織（剔除染色后脫片面積＞50%的組織）中METTL3的表達情況（見圖2D）。與上述結果一致，METTL3在結腸癌組織中表達上調（P＜0.001，見圖2E；P=0.040，見圖2F）。

圖1 METTL3基因在不同腫瘤中的表達特征

圖2 METTL3在結腸癌組織中mRNA和蛋白表達顯著升高

2.2 METTL3 高表達提示結腸癌患者的不良臨床結局 我們進一步綜合分析了TCGA-COAD數據庫和GEO數據庫（GSE17563、GSE17537、GSE29621、GSE39582）中共計1 278例結腸癌患者的表達譜數據及其臨床信息，其中表達數據經去除批次效應后合并。基于METTL3的表達水平將結腸癌患者分為高表達組和低表達組；2組患者的生存狀態差異有統計學意義（P=0.019），而性別和TNM分期差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。Kaplan-Meier生存分析進一步顯示了METTL3高表達提示結腸癌患者較差的OS（Log-rankP=0.028）和DFS（Log-rankP= 0.035），見圖3。同時，單因素和多因素Cox回歸分析結果顯示，結腸癌TNM分期的II期（HR=1.913，P=0.022），III期（HR=2.903，P＜0.001），IV期（HR= 11.206，P＜0.001），以及METTL3的高表達（HR= 1.335，P=0.030）是患者不良臨床結局的獨立危險因素（見表2）。

表2 公共數據庫1 278例結腸癌患者生存預后的單因素和多因素Cox回歸分析

圖3 Kaplan-Meier曲線展示TCGA數據庫合并GEO數據庫中結腸癌患者總生存期（A）和無病生存期（B）與METTL3表達的相關性

2.5 敲低METTL3表達顯著抑制結腸癌細胞增殖能力 Western blot結果顯示，si-METTL3-1 和si-METTL3-2可顯著敲低結腸癌細胞內METTL3的表達水平。CCK-8細胞增殖實驗結果顯示，METTL3敲低后的HCT-116細胞增殖能力顯著低于si-NC組（P＜0.001）。同樣的，此現象在DLD-1 細胞中也得到驗證（P＜0.001）。見圖4。以上結果證實了METTL3的表達水平對于結腸癌細胞增殖能力具有重要作用，METTL3能促進結腸癌細胞的增殖能力。

圖4 CCK8實驗評估下調METTL3的表達對結腸癌細胞增殖能力的影響

2.6 敲低METTL3表達顯著抑制結腸癌細胞遷移與侵襲能力 Transwell細胞遷移和侵襲實驗結果表明，在METTL3敲低后，HCT-116和DLD-1細胞遷移與侵襲能力顯著低于si-NC組（P＜0.05），見圖5。

圖5 Transwell實驗評估敲低METTL3對結腸癌細胞DLD-1和HCT-116遷移和侵襲能力的影響

3 討論

結腸癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，目前尚缺少有效預測結腸癌患者生存的分子標志物及治療靶點。因此，亟需尋找影響結腸癌惡性進展及患者預后的關鍵調控基因，對于結腸癌的防治具有重要意義。m6A修飾普遍存在于真核生物mRNA中，其最早于40年前首次報道，但其在人類疾病，尤其是惡性腫瘤中的生物學功能直到最近才成為研究的焦點[14-15]。METTL3作為m6A修飾主要的甲基轉移酶，介導了諸多m6A修飾的生物學功能。本研究旨在明確METTL3在結腸癌中的表達情況及臨床意義，并初步探索METTL3對結腸癌發生發展中的生物學功能。

通過大樣本量公共數據庫生物信息學分析和本中心臨床組織免疫組織化學法驗證，本研究證實了METTL3在結腸癌組織中表達顯著上調。與本研究結果相似，LI等[16]通過qRT-PCR和Western blot技術檢測發現結腸癌組織標本中METTL3的mRNA和蛋白水平要高于癌旁正常組織。此外，本研究分析發現METTL3高表達與結腸癌患者較差的OS和DFS密切相關；單因素和多因素Cox回歸分析進一步證實METTL3可以作為預測結腸癌患者預后的獨立危險因素。這些結果提示了METTL3可能在結腸癌的發生發展在發揮了重要作用。然而，METTL3對結腸癌細胞生物學功能的影響尚不清楚。

本研究中我們通過siRNA靶向敲低結腸癌細胞中METTL3的表達水平，發現結腸癌細胞系DLD-1和HCT-116的增殖能力得到顯著抑制。上述結果與HAN等[17]研究結果相似，其研究發現METTL3以m6A依賴的途徑調控pri-miR21/222成熟，并促進細胞增殖。WANG等[12]也同樣證實了過表達METTL3能夠促進胃癌細胞增殖，而敲低METTL3表達能夠抑制胃癌細胞增殖。

此外，Transwell實驗結果證實了敲低METTL3的表達能夠顯著抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲實驗。YUE等[18]發現METTL3通過調節胃癌細胞上皮-間質轉換并促進胃癌轉移。同時，HE等[19]研究結果進一步發現敲低METTL3的表達后能顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的轉移能力。以上結果充分證實了METTL3作為重要的致癌基因，參與了結腸癌的惡性進展及惡性細胞表型，但具體機制有待進一步的研究。

本研究的局限在于，缺乏動物水平實驗證METTL3對結腸癌細胞生物學表型的影響，同時沒有進一步挖掘METTL3促進結腸癌細胞增殖和轉移等惡性表型的深層分子機制。此外，本研究還需進一步收集結腸癌臨床組織樣本對應的臨床信息，并從本中心水平探究METTL3表達與結腸癌患者臨床病理特征和預后的相關性。

總而言之，本研究通過大樣本量結腸癌公共數據庫及臨床組織標本證實METTL3在結腸癌組織中表達上調，并可以作為獨立危險因素預測結腸癌患者的不良預后。此外，細胞功能學實驗進一步證實METTL3能夠促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究初步揭示了METTL3在結腸癌發生發展中的作用，為結腸癌的治療和靶點挖掘提供一定的理論支持。