中線蛋白2在胃癌中表達上調并促進胃癌細胞惡性表型

陳謝滔，胡賢靜，邱天樂，沈賢，薛向陽

1.溫州醫科大學 微生物與免疫學教研室 分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院 麻醉科，浙江 溫州 325027；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

胃癌（gastric cancer, GC）是世界上第五大常見的癌癥和第四大癌癥相關死亡原因[1]。近年來，盡管在外科手術和化療方面取得了一些進展，但GC患者的五年生存率仍不足10%，這主要是由于大部分的胃癌患者被發現時已經處于進展期，導致其對術后化療或者新型免疫療法的響應率和獲益率并不理想[2-4]。因此，尋找GC診斷的新生物標志物或新型治療靶點，并進一步探究GC惡性進展的分子機制，對于改善患者的預后是非常重要的。

中線蛋白2（midline 2, MID2）也稱為三方基序蛋白1（tripartite motif-containing protein 1, TRIM1），屬于TRIM蛋白家族成員[5]。TRIM家族有超過70個成員，被報道參與多種細胞過程和信號通路，其大多數成員都具有E3泛素連接酶活性。現有的研究結果表明，MID2參與激活NF-κB/AP-1信號通路，這提示我們該蛋白可能在腫瘤進展中發揮重要作用[6]；MID2在乳腺癌細胞中高表達，能促進乳腺癌細胞的增殖和致瘤性，可能是乳腺癌的一個有價值的治療靶點[7]。但關于MID2在胃癌細胞中的表達情況及作用研究鮮有報道。本研究通過溫州醫科大學附屬第一醫院的胃癌臨床樣本及公共數據庫綜合評估了MID2在胃癌中的表達特點和預后影響，通過細胞實驗評估了MID2在胃癌細胞中的生物學效應，旨在對胃癌潛在治療靶點的發現做出一定貢獻。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人胃癌細胞BGC-823和SGC-7901均購自中國科學院細胞庫。用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱。

1.1.2 試劑：胎牛血清、DMEM培養基購自美國 Gibco公司；MID2兔多克隆抗體購自美國Thermo Fisher Scientific公司；GAPDH兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司；兔二抗購自美國Proteintech 公司；Western blot配置試劑盒及細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；CCK-8試劑購自日本同仁公司；Transwell小室購自美國康寧公司；基質膠購自美國BD生物科技有限公司；MID2質粒構建序列為前向引物：CCCAAGCTTGCCACCATGGGTGA AAGCCCAGCC；后向引物：CCGGAATTCCTATTAAGCGTAG TCTGGGACGTCGTATGGGTAATGACAGGTTTTCATCCCA，引物購于北京六合華大基因科技有限公司；質粒構建所需切膠回收、純化、大提試劑盒均購自美國Omega Bio-tek公司。靶向MID2的小干擾RNA（siRNA）序列為GCGCAACAGCGAACTAGAA（5’-3’），委托廣州銳博生物科技有限公司進行合成。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：用于組織芯片分析的胃癌標本收集自2014年1月至2016年12月于溫州醫科大學附屬第一醫院行胃癌根治性切除手術的患者，包括420例胃癌組織和41例對應的癌旁正常組織（距腫瘤切緣至少10 cm）。剔除脫片的組織后，對組織染色情況進行分析，計算陽性區域光密度值/腫瘤總面積光密度值，得到MID2-Score評分。本研究獲溫州醫科大學附屬第一醫院倫理審查委員會的批準（批號：2019046）。

1.2.2 生物信息學分析：使用R的TCGAbiolinks包下載TCGA數據庫中胃腺癌患者的基因表達數據和臨床數據。根據ROC曲線最大約登指數確定MID2表達量預測生存的最佳分組截斷值。R的survival（3.3.1），survminer，ggplot2（3.3.6）包被用于進行生存分析。

1.2.3 免疫組化：將組織芯片放入65 ℃烘箱中2 h 脫蠟；梯度乙醇浸泡后附水；抗原修復后用免疫組化筆圈出組織邊緣，5%的山羊血清封閉30 min；封閉完成后滴加MID2多克隆抗體室溫下孵育2 h；二抗孵育30 min；DAB顯色液（50×）孵育10 min；蘇木素染色，過鹽酸乙醇分化；PBS溶液反藍后梯度乙醇脫水；二甲苯浸泡5 min后中性樹脂封片保存。使用數字切片系統對組織芯片進行全視野掃描，使用CaseViewer軟件對掃描的芯片進行觀察；采用Image-ProPlus軟件對抗體染色強度進行量化并分析。

1.2.4 MID2 質粒構建：從NCBI官網檢索并下載MID2基因的蛋白質編碼序列，設計帶有特異性內切酶位點的前后向引物；使用高保真酶以胃癌細胞BGC-823的cDNA為模板，擴增目的基因片段；核酸膠電泳分離目的條帶后使用切膠回收試劑盒回收PCR產物；使用特異性內切酶將PCR產物和pcDNA3.1野生型質粒同時進行雙酶切；酶切產物純化分離后使用T4連接酶進行酶連。酶連條件：16 ℃反應 16 h；使用DH5α感受態細胞進行酶連產物轉化并涂板；挑取單克隆菌置于含AMP的LB培養液中，37 ℃恒溫搖床擴增菌液；吸取單克隆菌液送DNA測序；序列驗證成功后將菌液擴大培養，使用大提試劑盒進行質粒提取，得到pcDNA3.1-MID2-HA重組質粒，測定質粒濃度。

1.2.5 Western blot實驗：將胃癌細胞鋪板于6孔板中，轉染質粒或si-RNA，培養箱中培養48 h；使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白；配置濃度為10%的SDS-PAGE凝膠；電泳分離蛋白樣（電泳條件：80 V 30 min；120 V 60 min）；電泳完成后于冰水浴中將蛋白轉印至PVDF膜（轉膜條件80 V 90 min）；轉膜結束后將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，室溫下搖床封閉40 min；加入1:1 000稀釋的MID2兔多克隆抗體，于4 ℃搖床上孵育過夜；兔二抗室溫下搖床孵育2 h，最后TBST洗膜并使用ECL發光試劑進行顯色并曝光。

1.2.6 CCK-8細胞增殖實驗：將胃癌細胞以合適密度接種于96孔板（4 000～5 000個/孔），待細胞完全貼壁后按照lip2000 轉染說明書轉染質粒或si-RNA，轉染8 h后換液；分別于轉染后24、48、72、96 h吸棄培養基，每孔加入100 μL用無血清培養基稀釋的CCK-8試劑，培養箱中孵育3 h；孵育完成后吸取90 μL液體轉移至新的96孔板中，避光條件下酶標儀檢測OD值。

1.2.7 Transwell實驗：將合適密度的細胞接種到6 孔板中；待細胞完全貼壁后按照lip2000 轉染說明書轉染質粒或si-RNA，轉染8 h后換液；轉染后 48 h開始進行遷移及侵襲實驗；在實驗前2 h，于 4 ℃冰箱解凍緩慢解凍基質膠；用PBS稀釋基質膠至終濃度為0.5 mg/mL；取出小室置于24孔板中，每小室加入200 μL基質膠，置于培養箱中孵育；轉染48 h后，胰酶消化細胞并離心，用不含血清的培養基重懸并稀釋細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL； 于培養箱中取出小室，吸盡PBS，每個小室加入 200 μL稀釋好的細胞懸液，下室加入600 μL含10% 胎牛血清的完全培養基，水平置于培養箱中；根據不同細胞特性于特定時間取出小室，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色10 min，清水洗凈后晾干；正置顯微鏡下觀察細胞穿出情況，按上-中-左-右-下順序取5個視野拍攝，對視野中的染色細胞進行計數并統計分析。

1.3 統計學處理方法 使用SPSS22.0軟件進行統計學分析，Graphpad Prism 8.0進行實驗作圖，R 4.0.2進行生物信息學分析。正態分布的計量資料以表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析，采用Logrank檢驗評估2組患者生存狀態的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MID2在胃癌組織中高表達并提示較差的預后 胃癌組織芯片的免疫組化染色結果表明，MID2在胃癌組織及癌旁組織中均有表達，且主要表達在細胞漿中，鏡下可見MID2在癌旁組織及胃癌組織中主要表達于管狀腺，且胃癌組織中呈現強陽性而癌旁組織呈現弱陽性（見圖1A）。在剔除脫片、非特異性染色等情況后，28對胃癌組織與癌旁配對組織中MID2-Score的數值差異表明，MID2在胃癌中的整體表達量要高于癌旁組織（P＜0.05，見圖1B）。同時配對分析顯示，MID2蛋白表達水平在胃癌組織中要顯著高于配對的癌旁組織（P＜0.01，見圖1C）。在剔除65例脫片組織后，根據ROC曲線分析結果將胃癌患者分為MID2高表達組（101例）和MID2低表達組（254例）進行生存分析，Kaplan-Meier生存曲線顯示高MID2蛋白表達水平預示著胃癌患者更差的預后（P=0.055，見圖1D）。

圖1 MID2在胃癌中的表達情況

對TCGA胃癌臨床數據進行分析也得到了相似的結論，MID2 高表達患者的總體生存期（overall survival，OS；Log-rankP=0.002）、無病生存期（disease-free survival，DFS；Log-rankP=0.002）、無進展生存期（progression-free survival, PFS；Log-rankP=0.003）均顯著低于MID2低表達患者，見圖2A-C。其中在針對不同病理分期的亞組生存分析中，MID2表達量高低對于III期患者OS的影響最顯著（見圖2D）。這一部分結果表明MID2在胃癌組織中高表達且與胃癌患者不良預后相關，并提示其可能作為一個致癌基因在胃癌中發揮作用。

圖2 TCGA胃癌數據庫中MID2表達的預后分析

2.2 上調MID2表達促進胃癌細胞增殖能力 為了評估MID2對胃癌細胞惡性表型的影響，首先通過Western blot檢測了MID2蛋白在各胃癌細胞系中的基礎表達水平，結果表明MID2蛋白在BGC-823、SGC-7901、AGS、HGC-27表達量相近，均較低，在MGC-803細胞中表達較高。因此我們選取MID2基礎表達較低的BGC-823及SGC-7901細胞系進行過表達，選取MID2基礎表達較高的MGC-803細胞系進行敲低（見圖3A）。我們設計構建了pcDNA3.1-MID2-HA重組質粒，將其轉染至BGC-823及SGC-7901細胞中，通過Western blot實驗驗證質粒在細胞內有效過表達（見圖3B）。隨后，通過CCK-8實驗證實上調MID2表達后能夠顯著促進胃癌細胞BGC-823和SGC-7901的增殖能力（P＜0.05，見圖3C）。

圖3 上調MID2促進胃癌細胞增殖能力

2.3 上調MID2表達促進胃癌細胞遷移及侵襲能力 Transwell小室遷移與侵襲實驗結果顯示，在過表達MID2后，BGC-823及SGC-7901細胞遷移與侵襲能力顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。以上結果證實了上調MID2表達能夠顯著促進胃癌細胞的遷移與侵襲能力。

圖4 上調MID2促進胃癌細胞遷移、侵襲能力

2.4 下調MID2表達抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力 為了進一步評估MID2對胃癌細胞生物學功能的影響，我們設計了靶向MID2的小干擾RNA（siRNA），選擇在MID2蛋白基礎表達量較高的MGC-803細胞中驗證其敲低效率。Western blot實驗顯示在MGC-803細胞中，siRNA能夠顯著敲低MID2蛋白的表達水平（見圖5A）。CCK-8實驗顯示敲低MID2能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖能力（P＜0.001），見圖5B。Transwell實驗表明敲低MID2的表達能夠顯著抑制胃癌細胞的遷移及侵襲能力（P＜0.001），見圖5C。

圖5 敲低MID2抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力

3 討論

細胞蛋白的泛素化在真核細胞的關鍵信號通路和蛋白質周轉的調節中起著關鍵作用。在協調泛素化方面非常重要的是E3泛素連接酶，因為這些蛋白質識別及底物修飾需要發生在正確的時間和地點。TRIM是E3泛素連接酶的主要亞類。TRIMs蛋白在調節癌細胞的生物學行為方面具有重要作用[6]，如細胞內信號傳導、固有免疫、細胞轉錄、自噬和癌變[8-10]。在腫瘤治療過程中，TRIMs蛋白可以通過調節腫瘤的各個方面發揮作用，如腫瘤的增殖、轉移、凋亡和耐藥的發展等[11-12]。TRIM8、TRIM24、TRIM28和TRIM32在惡性腫瘤組織中高表達并參與惡性生物學行為[13]，并且絕大多數高表達的TRIMs蛋白提示胃腸道腫瘤患者預后不良，如胃癌組織中高表達的TRIM32[14]、TRIM54[15]等。MID2又稱作TRIM1，做為TRIM家族中的一員，關于其在胃癌中的生物學效應尚缺乏足夠的報道。

在本研究中，通過本中心的胃癌標本聯合TCGA數據庫分析顯示，MID2 在胃癌組織中高表達并提示較差的預后。與本結果相似，AGUILAR等[16]報道MID2的表達與乳腺癌患者的預后有關，MID2 mRNA和蛋白水平在乳腺癌細胞和乳腺癌組織中表達上 調[7]，然而除此之外，MID2 在其他腫瘤中的生物學表型及作用仍未得到足夠研究。之后我們探究了MID2在胃癌細胞中的生物學效應，通過CCK-8及Transwell實驗，發現上調MID2表達能顯著促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，下調MID2表達抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。之前的研究也同樣證實MID2的上調能夠促進乳腺癌細胞的增殖，敲低MID2的表達顯著降低乳腺癌細胞的增殖速率[6]。

關于MID2在腫瘤細胞中發揮效應的機制，有研究報道MID2通過激活NF-κB/AP-1來影響NF-κB信號通路。NF-κB是參與癌細胞過程的關鍵調控因子，包括細胞增殖、轉移和上皮-間質轉化[17-18]。除此之外，在細胞分裂期間MID2可以直接于Astrin的N-末端結合，并在以MID2依賴的方式使Astrin-K409處泛素化，最終導致Astrin降解從而促進細胞的分裂[19]。 這將可能是MID2促進腫瘤細胞增殖機制探索的切入點。而關于MID2通過何種機制進而影響胃癌細胞表型，仍是我們需要思考并進行后續研究的重點。

綜上所述，我們發現MID2在胃癌組織中表達上調，且與胃癌患者的不良預后密切相關。上調MID2能顯著促進胃癌細胞的增殖、遷移與侵襲能力，但其發揮生物學功能的具體機制有待進一步研究。