食品中一種新型伐地那非結構類似物的篩查與定量測定

劉雅婷，郭予昕，劉振強，劉建平，王 歡，劉 洋，戴潔蕓，王美玲*

（1.中國檢驗認證集團湖南有限公司，湖南 長沙 410021；2.長沙海關技術中心，湖南 長沙 410004）

近年來，一些不法商家為了牟取暴利和逃脫監管，在食品中非法添加新型那非類、拉非類等磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑的結構類似物［1-12］。這些結構類似物通常由磷酸二酯酶-5 抑制劑的母核結構進行化學修飾、改變部分官能團而得到，由于未經國家藥品監督管理部門批準，缺乏藥理和毒性實驗數據，服用后的不良反應難預料，嚴重危害群眾身體健康［13-14］。為加強食品安全監管，打擊食品違法犯罪，國家監管部門陸續頒布了保健食品或食品中非法添加西地那非等PDE-5抑制劑的多個補充檢驗方法［15-18］，涉及100多種化合物。但現有檢測方法僅針對指定的化合物檢測列表進行靶向檢測，無法對新型PDE-5抑制劑結構類似物進行鑒別和準確定量，易產生漏檢和假陰性結果。市面上新型PDE-5抑制劑結構類似物不斷出現，其結構未知且缺乏標準品，急需建立快速、準確的定性鑒定和定量分析方法，為食品安全監管提供有力的技術支持。

本研究采用液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜對壓片糖果中那非類物質進行篩查，發現一種新型的伐地那非結構類似物，推導出其裂解規律，通過紅外光譜、核磁共振譜進行定性解析，最終確定該物質為丙氧基伐地那非，并采用高效液相色譜-串聯質譜進行定量分析。為食品中非法添加的新型PDE-5抑制劑結構類似物的篩查、鑒定與定量分析提供了快速、準確、有效的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（配PAD 檢測器，日本島津公司）；LC-8A 型制備液相色譜儀（配UV檢測器，日本島津公司）；AB Triple Quad 5500 三重四極桿串聯質譜儀（美國SCIEX 公司）；SCIEX X500R QTOF 超高壓液相色譜/四極桿-飛行時間質譜儀（美國SCIEX 公司）；Thermo Nicolet 380N 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo 公司）；核磁共振儀（德國Bruker 公司）；XS105 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山舒美公司）；渦旋振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；H1750離心機（湖南湘儀公司）。

甲醇、乙腈為色譜純（上海安譜科學儀器有限公司），其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水（美國Millipore超純水儀制備）；那非類快速檢測試紙條（深圳市易瑞生物技術股份有限公司）；伐地那非標準物質（純度大于98%，上海安譜實驗科技股份有限公司）。90種那非類藥物混標（10 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。壓片糖果、保健酒、蜂蜜醬等購自網絡平臺。樣品制備：固體試樣搗碎，混勻；液體試樣，充分混勻。

1.2 標準溶液配制

精密稱取伐地那非10 mg 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至10 mL，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃保存，有效期6個月。

1.3 樣品前處理

精密稱取1 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲提取15 min，放冷至室溫，用甲醇定容，轉移至50 mL 離心管中，5 000 r/min 離心5 min，上清液經0.22 μm 有機微孔濾膜過濾。取濾液，根據實際濃度用50%甲醇水溶液稀釋至線性范圍內，備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為1%乙酸水溶液，采用二元等度洗脫（70% A、30% B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL，柱溫：30 ℃。PAD掃描，波長范圍為200～400 nm。

1.4.2 液相色譜-串聯質譜條件色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC- C18（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫：0.0～3.0 min，10% B；3.0～8.0 min，10%～50% B；8.0～9.0 min，50%～70% B；9.0～9.5 min，70%～90% B；9.5～11.4 min，90% B；11.4～11.5 min，90%～10% B；11.5～15 min，10% B。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子；掃描方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：5 000 V；氣簾氣（CUR）：137.9 kPa；霧化氣（GS1）：379.2 kPa；輔助加熱氣（GS2）：413.7 kPa；碰撞氣（CAD）：55.2 kPa；離子源溫度（TEM）：500 ℃；監測離子對：m/z503.2/151.2（定量離子對）；m/z503.2/299.1（定性離子對）。

1.4.3 液相色譜-高分辨質譜條件色譜條件：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫：0.0～1.0 min，20% B；1.0～1.5 min，20%～95% B；1.5～5.5 min，95% B；5.5～6.0 min，95%～ 20% B；6.0～9.0 min，20% B。

質譜條件：ESI，正離子；掃描方式：TOF-MS/MS 模式；電噴霧電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：379.2 kPa；輔助氣壓力：379.2 kPa；離子源溫度：500 ℃。全掃描一級質譜（MS），質量采集范圍為100～1 000 Da；全掃描二級質譜（MS/MS），質量采集范圍為50～600 Da。

2 結果與討論

2.1 定性測定

2.1.1 那非類快檢試劑盒測定按照快檢試劑盒的操作步驟對壓片糖果樣品進行檢測，結果呈陽性，表明樣品中可能含有那非類物質。

2.1.2 液相色譜測定將壓片糖果按“1.4.1”色譜條件進行定性分析，發現色譜圖中8.54 min 處出現1 個色譜峰（見圖1A），其保留時間與伐地那非標準物質相近。在200～400 nm 波長范圍內，該色譜峰的光譜圖與伐地那非標準物質的光譜圖一致，在226 nm處均有最大吸收（見圖1B）。因此推測該壓片糖果中可能含有伐地那非結構類似物。

圖1 壓片糖果中未知化合物的色譜圖（A），以及未知化合物與伐地那非標準物質的光譜圖比較（B）Fig.1 Chromatogram of the unknown compound in a pressed candy（A），UV spectra of the unknown compound and vardenafil standard（B）

2.1.3 液相色譜-串聯質譜測定將樣品按照BJS 201805《食品中那非類物質的測定》［18］進行前處理后，采用液相色譜-串聯質譜進行定性測定，結果未檢出標準方法涵蓋的90種那非類物質。但在MRM提取離子流色譜圖中新出現1 個色譜峰，其保留時間與標準方法中伐地那非N-氧化物和丙氧苯基艾地那非均不同，但同時具有兩者的特征監測離子對m/z505.2/151.1（伐地那非N-氧化物）和m/z503.2/283.2（丙氧苯基艾地那非），m/z503.2 與m/z505.2 相差2 amu，可能是同位素峰，從而推測該化合物可能為那非類結構類似物。

2.1.4 高分辨質譜篩查按照“1.4.3”條件進行定性篩查，在壓片糖果樣品總離子流色譜圖的6.531 min 處出現1 個色譜峰（見圖2A），其準分子離子峰為m/z503.234 9（［M+H］+），推測該化合物的分子式為C24H34N6O4S，與伐地那非的準分子離子峰m/z489.219 9（［M+H］+）相差14.015 0 amu，可能多1個CH2基團。二級質譜掃描中主要的特征碎片離子為m/z391.135 9、376.108 4、326.177 7、299.118 1、284.130 0、151.088 6（圖2B）。其中m/z299.118 1、m/z284.130 0、m/z151.088 6均與伐地那非的特征碎片離子相同，而m/z391.135 9、m/z326.177 7 均比伐地那非的特征碎片離子m/z377.124 8、m/z312.161 0 大14 amu，說明該化合物具有伐地那非的母核結構，而取代基略有不同，可能多1 個CH2基團。結合伐地那非的結構和裂解規律［19-20］，推測該化合物可能為伐地那非苯環上的乙氧基被丙氧基代替，其裂解途徑如圖3所示。

圖2 樣品中未知化合物的色譜圖（A）和二級碎片離子質譜圖（B）Fig.2 Chromatogram（A） and secondary fragment MS spectrum（B） of the unknown compound in a sample

圖3 未知化合物的質譜裂解途徑Fig.3 MS fragment pathway of unknown compound

2.1.5 分離純化目標化合物稱取約25 g 樣品于500 mL 錐形瓶中，加入100 mL 甲醇，超聲提取15 min，5 000 r/min 離心5 min，上層清液過濾。取濾液，重復提取2 次，濾液旋轉蒸發濃縮至約10 mL，采用制備色譜純化，色譜條件為甲醇-1%乙酸水溶液（70∶30）；檢測波長為230 nm，流速為10 mL/min。收集主色譜峰成分，減壓蒸發除去溶劑后冷凍干燥，即得純化目標化合物（約100 mg）。

稱取純化后的目標化合物20 mg 置于50 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度并混合均勻，即得測試溶液。將測試溶液按“1.4.1”條件測定，檢測波長為230 nm，采用峰面積歸一化法進行定量分析，得到純度為98.0%。

2.1.6 紅外光譜鑒定取“2.1.5”純化樣品進行紅外光譜測定，光譜圖顯示含有仲氨基、苯環、甲基、亞甲基、羰基、咪唑環、碳氮雙鍵、砜基、碳氮單鍵和碳氧單鍵等官能團的特征吸收峰。具體如下：①仲氨基的氮氫伸縮振動吸收峰（3 181、3 119 cm-1）；②苯環的碳氫伸縮振動和面外彎曲振動吸收峰（3 076、824、772、737、729 cm-1）；③甲基和亞甲基的碳氫伸縮振動和彎曲振動吸收峰（2 963、2 879、2 851、2 816、1 485、1 462、1 456、1 383 cm-1）；④羰基的特征吸收峰（1 692 cm-1）；⑤苯環和咪唑環的骨架伸縮振動吸收峰、碳氮雙鍵伸縮振動吸收峰（1 622、1 597 cm-1）；⑥砜基的特征吸收峰、碳氮單鍵和碳氧單鍵的伸縮振動吸收峰（1 350、1 325、1 306、1 275、1 171、1 146、1 117 cm-1）。因此，樣品中的未知化合物與伐地那非具有相似的特征官能團。

2.1.7 核磁共振譜圖及結構確證取“2.1.5”純化樣品，以DMSO-D6為溶劑，測試核磁共振氫譜（1H NMR）、碳-13 核磁共振譜（13C NMR）、無畸變極化轉移譜（DEPT135）、同核位移相關譜（COSY）、異核單量子相關譜（HSQC）和異核多鍵相關譜（HMBC）（見圖4）。1H NMR、COSY 譜數據和13C NMR、DEPT135、HSQC、HMBC 譜數據分別見表1 和表2。1H NMR 譜顯示34 個質子信號；其中1 個活潑氫、4 個甲基、9 個亞甲基和1 個1，2，4-三取代苯環的質子信號。13C NMR 譜顯示22 根碳譜線，哌嗪環結構對稱，2 對碳信號兩兩重疊，與質譜分析所得分子式（C24H34N6O4S）一致，比較1H NMR 譜和1H NMR（+D2O）譜發現，活潑氫信號明顯減弱至消失，歸屬為仲氨基的質子信號。通過1H NMR 譜、13C NMR 譜和DEPT135 譜，確定了4 個甲基、9 個亞甲基和1 個1，2，4-三取代苯環。結合HMBC 譜、HSQC 譜和COSY 譜可以確定相連的體系。綜合質譜、紅外光譜和核磁共振譜結果，確定該化合物為丙氧基伐地那非，由伐地那非苯環上的乙氧基被丙氧基代替而得到，其結構式見圖5。

表1 未知化合物的核磁共振1H NMR與COSY譜數據Table 1 1H NMR and COSY data of the unknown compound

表2 未知化合物的核磁共振13C NMR、DEPT135、HSQC與HMBC譜數據Table 2 13C NMR，DEPT135，HSQC and HMBC data of the unknown compound

（續表2）

圖4 未知化合物的1H NMR譜（A）與13C NMR譜（B）Fig.4 1H NMR（A） and 13C NMR（B） spectra of unknown compound

圖5 丙氧基伐地那非的結構Fig.5 Structure of O-propylvardenafil

2.2 定量分析

2.2.1 標準溶液配制精密稱取丙氧基伐地那非10 mg于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至10 mL，配制成質量濃度為1.0 mg/mL 的標準儲備液。準確吸取丙氧基伐地那非儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋，搖勻，配制成質量濃度依次為1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 ng/mL的系列標準工作液。

2.2.2 線性關系、檢出限與定量下限取“2.2.1”標準工作液，按照“1.3”和“1.4.2”方法分別進行前處理和上機測定，采用外標法定量，以目標化合物的峰面積（y）對質量濃度（x）繪制標準曲線。目標化合物在1.0～100 ng/mL 范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y=12 606.33x-504.97，相關系數（r2）為0.999 2。以3 倍信噪比（S/N≥3）對應的空白樣品添加質量濃度作為方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）對應的空白樣品添加質量濃度作為方法的定量下限（LOQ），得到丙氧基伐地那非的檢出限為0.02 mg/kg，定量下限為0.05 mg/kg。

2.2.3 基質效應采用提取后添加法評價基質效應（ME）的影響，將空白樣品基質提取液用50%甲醇水溶液稀釋不同倍數（10、20、50、100倍）后配制20 ng/mL 標準溶液進行測定。按下式計算基質效應：ME（%）=（Aae-As）/As×100%，式中Aae為樣品基質溶液中化合物的峰面積平均值；As為標準溶液中化合物的峰面積平均值。ME 的絕對值隨著基質效應的增強而變大，ME 為正值說明存在基質增強效應，負值則為基質抑制效應。當ME絕對值＜20%時表示基質效應較弱，ME絕對值在20%～50%范圍內時表示具有中等強度基質效應，ME絕對值大于50%時表示基質效應較強。

結果表明，保健酒和蜂蜜醬的ME 在±20%之間，基質效應較小。壓片糖果有一定的基質效應，當采用50%甲醇水溶液將空白基質稀釋50倍后，基質效應有所減弱。因此，陽性樣品在前處理中增加稀釋過程，以降低基質效應的影響。根據需要可采用空白基質提取液配制適當濃度的基質標準工作溶液進行定量。

2.2.4 回收率與相對標準偏差在壓片糖果、保健酒和蜂蜜醬3種空白基質樣品中，添加低、中、高3 個濃度水平的丙氧基伐地那非，分別制成0.05、0.1、0.5 mg/kg 的樣品，每個濃度做6 次平行實驗，考察方法的回收率和相對標準偏差（RSD）。表3 結果顯示，不同加標水平下的平均回收率為76.5%～104%，RSD為1.6%～5.1%，滿足分析要求。

表3 食品中丙氧基伐地那非的平均加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of O-propylvardenafil in foods（n=6）

2.3 實際樣品測定

采用本方法對網購的100 批次樣品進行測定。結果表明，有5 批次糖果（含人參牡蠣壓片糖果和人參糖）檢出丙氧基伐地那非，含量為510～3.23×104mg/kg；3批次養生保健酒檢出丙氧基伐地那非，含量為180～730 mg/kg。

3 結 論

本研究建立了一種快速、靈敏、準確的篩查和鑒定PDE-5抑制劑新型結構類似物的方法。通過高效液相色譜篩查、高分辨質譜初步推測、紅外光譜和核磁共振進一步確證，發現并鑒定了一種新型的非法添加物丙氧基伐地那非。該化合物在國內未見報道，尚無相關檢驗標準，課題組目前已申請該化合物的CAS號登記，并進行標準物質研制，為打擊食品違法犯罪提供了技術支撐。