QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法測定巧克力中的18種合成大麻素

史洪飛，徐伯芃，徐成鑫，周修齊，張呂悅，張玉曼，冶 金，劉 暢

（南京警察學院 刑事科學技術學院，江蘇 南京 210023）

合成大麻素是一類新精神活性物質，其與四氫大麻酚類天然大麻素的作用機理相似，通過與大麻素受體結合發揮作用，且精神活性作用更強［1］。長期吸食合成大麻素會對大腦、肝臟、心血管系統產生嚴重損傷，引發精神錯亂等多種疾病［2-3］。合成大麻素種類較多，根據其化學結構特征可分為天然大麻素類似物、吲哚類、吲唑類、4-氮雜吲唑類、苯并咪唑類、茚類、咔唑類、吡咯類、吡唑類［4-6］。中國裁判文書網相關數據顯示，2017 至2022 年，全國共破獲151 起合成大麻素類涉毒案件（電子煙油90起、香草煙絲58 起、膠囊藥物2 起、飲料1 起），82 份明確說明合成大麻素種類的判決文書中77 份為吲唑類合成大麻素、7 份為吲哚類合成大麻素。吲唑和吲哚類合成大麻素是目前主要的涉案類型，電子煙油和香草煙絲為主要的添加基質，飲料、巧克力和軟糖等食品則涉案較少。近年來公安機關對含有合成大麻素的電子煙油和香草煙絲的打擊力度不斷加強，同時《電子煙管理辦法》的推行限制了調味電子煙和可自行添加霧化物電子煙的銷售，大大提高了通過電子煙和香草煙絲偽裝販賣毒品的風險。巧克力等由于便于攜帶、口感較好，深受大眾喜愛，市場流通量較大，為毒品提供了良好的隱藏環境。2021～2022年國家林業局司法鑒定中心共受理6起巧克力、軟糖基質中添加大麻素的案件。巧克力等食品可能成為未來合成大麻素添加的一類常見基質［7-9］。

目前，檢測合成大麻素的方法主要有差分拉曼光譜法［10-12］、氣相色譜-質譜法［8，13-19］、氣相色譜-串聯質譜法［20］、液相色譜-串聯質譜法［21-37］、膠束毛細管電動色譜法［38］；研究的樣品基質有食品［8，36］、電子煙油［13-15，21］、香草煙絲［18-20，32-33］、血液［23-25］、毛發［26-30］、口腔液［31］、尿液［35］。合成大麻素的提取檢測研究基質多集中于生物檢材、電子煙油和香草煙絲，對于食品方面的研究較少。于聰聰等［7］利用甲醇直接提取基于液相色譜-串聯質譜法檢測黑巧克力中的5種天然大麻素，該方法分析速度快，但提取液中存在較多雜質，易對離子源造成污染，且基質效應較強，影響定量分析的準確性；唐慶強等［8］選擇豬肉、牛奶、橄欖油、蜂蜜、面包、茶葉、大豆、可樂飲料和啤酒為檢材，利用固相萃取法凈化、氮吹濃縮后基于氣相色譜-質譜法對6 種合成大麻素和3 種天然大麻素進行檢測，方法平均回收率為65.2%～117.9%；邵曼等［37］基于高效液相色譜-串聯質譜法對巧克力、軟糖、餅干、飲料、糕點、白酒中的8種天然大麻素進行檢測，選擇增強型脂質去除凈化劑（EMR-Lipid）凈化樣品，有效去除了巧克力中的脂質和軟糖中的膠質，并通過向提取液中添加10%的丙三醇甲醇溶液優化了氮吹濃縮條件，有效去除了雜質成分，方法平均回收率為89%～101%。

本文基于QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法，建立了巧克力中18種吲哚類和吲唑類合成大麻素的檢測方法，并探討了實驗過程中合成大麻素同分異構體的分辨問題，為巧克力產品的安全監管及風險防范提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜級，美國 Thermo Fisher 公司）；PSA 凈化劑、C18凈化劑（40～60 μm，青島邦凱高新技術材料有限公司）；黑巧克力（市售）。

18 種合成大麻素：5F-ADBICA、4F-MDMB-BUTICA、AMB-FUBICA、5F-MDMB-PICA、5FEMB-PICA、 MDMB-FUBICA、 5F-EDMB-PICA、 ADB-FUBINACA、 ADB-BUTINACA、 ADB-4en-PINACA、4F-MMB-BUTINACA、4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-EMB-PINACA、5FADB、MDMB-FUBINACA、MDMB-4en-PINACA、4F-ABUTINACA（99.9%，0.1 mg/mL，均由公安部物證鑒定中心提供）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290-6545 高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀配電噴霧雙噴離子源（Dual AJS ESI，美國Agilent公司）；ME104E 電子天平（精確至0.1 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Lab Dancer渦旋振蕩儀（德國IKA公司）；Pico17微量高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標準溶液配制

混合標準儲備溶液：精密移取18種合成大麻素的單個標準溶液各0.1 mL，置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻制成1 mg/L的混合標準儲備溶液。

系列混合標準工作溶液：精密移取18種合成大麻素的混合標準儲備溶液，用甲醇將其稀釋成質量濃度為1、5、10、25、50、75、100、150、200 μg/L的合成大麻素系列混合標準工作溶液。

1.4 加標樣品的制備

用小刀將巧克力切碎后稱取200.0 mg于2 mL 聚丙烯離心管中，分別精密移取10、20、30 μL 混合標準儲備溶液于巧克力中，50 ℃超聲水浴15 min 使巧克力融化并與合成大麻素充分混合，于2 ℃冷藏凝固為塊狀，制備18種合成大麻素加標量分別為50、100、150 μg/kg的巧克力樣品。

1.5 實驗條件

1.5.1 樣品前處理條件取離心試管中的巧克力樣品，用小刀切碎后，裝回該離心試管中，加入1 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，在50 ℃下超聲提取10 min，再次渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心3 min；取600 μL 上層清液于2 mL 微量離心管中，加入C18和PSA 凈化劑各0.05 g，渦旋振蕩3 min，以10 000 r/min離心3 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，移至進樣瓶中待測。

1.5.2 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；進樣量為5 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～2.0 min，10% ～65% B；2.0～6.0 min，65% B；6.0～7.0 min，65% ～90% B；7.0～9.0 min，90% B；9.0～9.5 min，90% ～10% B；9.5～11.0 min，10% B。

1.5.3 質譜條件離子源：Dual AJS ESI 源，正離子模式；毛細管電壓：4 000 V；誘導解離電壓：160 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 mL/min；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 mL/min；一級質譜數據采集為單級質譜全掃描模式（MS），掃描范圍為m/z100～600，采集速率為5 spectra/s。二級質譜數據采集為目標離子采集模式（Target MS/MS），一級質譜掃描范圍為m/z100～600，采集速率為1 spectra/s，二級質譜掃描范圍為m/z50～600，采集速率為4 spectra/s。采用參比離子（C5H4N4，嘌呤，其準分子離子精確質量數為121.050 9）實時質量校準。18種合成大麻素的保留時間、母離子精確質量數、子離子精確質量數等見表1。

表2 18種合成大麻素的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，r2，limits of detection and limits of quantitation of 18 synthetic cannabinoids

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的優化

合成大麻素的種類較多，互為同分異構體的合成大麻素在色譜保留和質譜碎片方面十分相似，檢驗認定存在一定困難。實驗通過色譜保留時間和二級質譜碎片實現了5F-EMB-PICA 與5F-MDMBPICA和5F-EMB-PINACA 與5F-ADB兩對同分異構體的區分。

2.1.1 色譜條件的優化對比了Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）和Eclipse Plus Phenyl-Hexyl（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）兩種色譜柱對18 種合成大麻素的分離效果。結果顯示，后者對合成大麻素的保留相對較強，但二者的選擇性無顯著差異，因此選擇出峰速度較快且應用更廣泛的C18色譜柱。通過優化流動相流速（0.3、0.35、0.4 mL/min）、流動相種類、梯度洗脫條件和柱溫箱溫度（30、40、50 ℃）成功將同分異構體5F-EMBPICA 與5F-MDMB-PICA 分離，其保留時間分別為5.15 min 和5.32 min，另一對同分異構體5FEMB-PINACA 與5F-ADB 在上述條件下均未實現分離。18 種合成大麻素的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 18種合成大麻素的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of the 18 synthetic cannabinoids the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.1.2 質譜條件的優化毛細管出口區域的碰撞誘導解離電壓對目標化合物準分子離子的響應影響較強，過高或過低均不利于提升方法靈敏度。碰撞誘導解離電壓過高時目標化合物易發生源內裂解，過低時化合物準分子離子的離子傳輸效率降低。本研究在MS采集模式下，考察了碎裂電壓在110～170 V范圍內18種合成大麻素準分子離子峰的響應情況，確定最佳碰撞誘導解離電壓為160 V。

在Target MS/MS 采集模式下調整碰撞能量，選取響應最強的子離子為定量離子，響應較強的離子為定性離子。優化碰撞能量，使定量離子的響應達到最強，確定18 種合成大麻素的最佳質譜參數如“1.5.3”所示。

2.1.3 同分異構體的分辨通過二級質譜碎片離子，能分辨未實現色譜分離的同分異構體 5F-EMBPINACA（二級質譜主要碎片離子為m/z233.107 5、304.181 6和332.177 0）與5F-ADB（二級質譜主要碎片離子為m/z233.107 5、318.197 3 和346.192 1），利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 軟件中的精確質量計算器，算得離子分子式分別為［C17H23FN3O］+、［C18H23FN3O2］+和［C18H25FN3O］+、［C19H25FN3O2］+，據此推斷5F-EMB-PINACA 與5F-ADB 的質譜裂解方式見圖2A和圖2B。參照二者的質譜裂解方式，可知另一對同分異構體5F-EMB-PICA 與5F-MDMB-PICA 亦存在相似的質譜裂解過程，除主要碎片離子m/z232.112 5 外，分別發現少量碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8，減小碰撞能，碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 和m/z317.202 1、345.195 8 的響應無顯著上升。利用精確質量計算器計算，離子分子式分別為［C18H24FN2O］+、［C19H24FN2O2］+和［C19H26FN2O］+、［C20H26FN2O2］+，推斷5F-EMB-PICA 與5F-MDMB-PICA 的質譜裂解方式見圖2C 和圖2D。兩對同分異構體的中心母體結構不同，實驗發現5F-EMB-PICA 的碎片離子m/z303.187 8、331.179 9 與5FMDMB-PICA 的碎片離子m/z317.202 1、345.195 8 穩定性較差，更易直接生成相同的碎片離子m/z232.112 5，兩者的質譜特征差異不明顯，可采用色譜保留時間結合二級質譜碎片的方式進行分辨。

圖2 4種合成大麻素的二級質譜圖及質譜裂解方式Fig.2 Secondary mass spectra and fragmentation pathways of the four synthetic cannabinoids

2.2 樣品提取條件的優化

2.2.1 提取溶劑的優化分別以1 mL甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，體積比）、甲醇-水（1∶1，體積比）、乙腈-水（1∶1，體積比）為提取溶劑，對0.2 g 巧克力樣品于50 ℃超聲提取15 min 后振蕩提取2 min；以10 000 r/min離心3 min后取上層清液過濾膜直接進樣。以母離子提取離子色譜圖的色譜峰面積為評價指標確定最優提取溶劑，結果如圖3所示。

圖3 提取溶劑對巧克力中18種合成大麻素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on the extraction effects of 18 synthetic cannabinoids in chocolate

結果顯示，除4F-ABUTINACA 外，其他合成大麻素以甲醇為提取溶劑時的提取效果較好，可能是由于4F-ABUTINACA 的甲酰胺上連接的取代基為金剛烷，使其與其他取代基為酯基和氨酰基的合成大麻素在溶解性方面存在較大差異，更適合用極性較弱的乙腈進行提取。由于本實驗的目標物多為酯基和氨酰基類合成大麻素，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 超聲提取條件的優化巧克力中可可脂的熔點約為34～38 ℃，因此選擇超聲溫度為50 ℃，以甲醇為提取溶劑分別超聲提取10、20、30 min，以母離子提取離子色譜圖的色譜峰面積為評價指標確定最佳提取時間。結果顯示，超聲提取時間對樣品提取效果的影響較小，為縮短前處理時間、減少雜質溶出，選擇樣品超聲提取時間為10 min。

2.3 凈化條件的優化

實驗考察了2 ℃冷藏保存12 h 后10 000 r/min 離心3 min 的方法對巧克力甲醇提取液的凈化效果，發現該方法能有效沉淀去除脂質等部分雜質，但耗時較長且無法實現色素成分的去除。因此實驗采用QuEChERS 前處理方法中的凈化方式，選擇PSA 和C18凈化劑對樣品中的極性和非極性雜質進行去除，通過提取液顏色和2 ℃冷藏保存12 h 后離心觀察是否有沉淀產生，判斷樣品中脂質、糖類等成分的去除情況，結合加標回收率確定凈化劑的添加量。結果表明，單獨添加0.01、0.02、0.05 g PSA 進行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為131%～146%、115%～127%和107%～125%；PSA 能有效去除樣品中的色素等極性成分，但無法去除脂質等非極性成分，冷藏后溶液有部分沉淀析出。單獨添加0.01、0.02、0.05 g C18進行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為130%～142%、119%～129%和98.4%～117%；C18能有效去除樣品中的脂質等非極性成分，冷藏后溶液澄清，但無法有效去除色素。同時添加C18和PSA 凈化劑各0.01、0.02、0.05 g 進行凈化時，18 種合成大麻素的回收率分別為121%～134%、110%～124%和90.6%～107%；添加C18和PSA 凈化劑各0.05 g 能夠有效去除色素等極性成分和脂質等非極性成分，且提取回收率較高。因此選擇凈化劑C18和PSA各0.05 g。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性及靈敏度采用本方法檢測系列混合標準工作溶液，以化合物的響應為縱坐標（y），對應質量濃度為橫坐標（x）繪制工作曲線。18 種合成大麻素均在1～200 μg/L 范圍內呈良好線性關系，相關系數不小于0.997 0，滿足定量分析要求。分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定化合物的檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），得到18種合成大麻素的檢出限和定量下限分別為0.02～0.20 μg/L和0.07～0.66 μg/L。

2.4.2 準確度與精密度采用本方法對空白巧克力樣品進行50、100、150 μg/kg 3 個水平的加標實驗，每種樣品平行3份，每個平行樣品進樣2次，計算方法回收率和相對標準偏差（RSD）。18種合成大麻素的回收率為86.2%～104%，RSD為0.070%～2.0%（見表3），表明該方法具有良好的準確度。

表3 18種合成大麻素的回收率與相對標準偏差（%）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 18 synthetic cannabinoids（%）

分別對同一瓶提取液進行6次連續進樣，一天內不同時間下重復實驗6次并進樣檢測，在6 天內由3名實驗人員重復實驗6次并進行檢測，以檢測濃度的RSD分別表示儀器精密度（Intra-sample）、日內方法精密度（Intra-day）和日間方法精密度（Inter-day）。如表3 所示，儀器RSD 為0.040%～2.0%，日內方法RSD為0.32%～3.0%，日間方法RSD為1.3%～3.6%，表明該方法具有良好的重現性。

2.5 實際樣品檢測

為驗證本方法的可靠性，參照“1.5”方法提取和檢測2份含有合成大麻素的巧克力檢材，分別檢出ADB-BUTINACA 和MDMB-FUBICA 成分，含量分別為0.51%和0.49%。

3 結 論

本文基于QuEChERS/高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜，建立了巧克力中18種合成大麻素的檢測方法。本方法有效降低了基質效應，使18種合成大麻素在11 min內實現了分離檢測，其中兩對同分異構體（5F-EMB-PICA 和5F-MDMB-PICA；5F-EMB-PINACA 和5F-ADB）實現了分辨。所建立的方法具有良好的靈敏度和穩定性，能夠滿足巧克力中合成大麻素的定性和定量分析需要，為巧克力產品的安全監管及風險防范奠定了技術基礎。