基于MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底的茶堿表面增強拉曼檢測

張曉琳，張 帆，劉艷坤，王志武，李 波，吳振剛，魏穎娜*，魏恒勇，李景武*

（1.華北理工大學 藥學院 河北 唐山 063210；2.華北理工大學 材料科學與工程學院 河北 唐山 063210；3.唐山市人民醫院 腫瘤研究所 河北 唐山 063001；4.華北科技學院 河北省危險化學品安全與控制技術重點實驗室 河北 廊坊 065201）

茶堿（Theophylline，THO）是茶葉中一種重要的嘌呤類生物堿，其化學結構與咖啡因高度相似。茶堿可舒緩支氣管平滑肌，強心利尿、緩解支氣管痙攣，主要用于治療支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病等［1］。與此同時茶堿又是違禁藥物咖啡因的主要代謝產物，因此茶堿成為運動賽場最常被檢出的違禁藥物之一［2-3］。而中藥中非法添加茶堿的不良現象，增大了藥品安全隱患［4］。因此對食品藥品中非法添加的茶堿進行檢測尤為重要［5-6］。

目前茶堿的檢測方法主要有氣相色譜、液相色譜、液相色譜-質譜、毛細管電泳、免疫分析和生物傳感等技術［7-8］，但這些方法操作均較為繁瑣、分析時間長且需要復雜的樣品前處理過程。表面增強拉曼光譜（SERS）在藥物分析領域的應用廣泛，其檢測靈敏度高，可達單分子檢測水平，且適合多元檢測，具有無損、用量少等優勢，《中國藥典》2015年版和2020年版將拉曼光譜法作為理化分析通則方法收載。SERS技術已在藥物研發、檢測和使用方面得到應用，涉及體內藥物檢測、痕量藥物檢測和中藥分析等領域［9］。然而，獲得高靈敏的SERS基底仍是實現藥物表面增強拉曼光譜檢測的關鍵技術之一。

氮化鈦（TiN）由于自身優異的熱穩定性、化學穩定性以及良好的生物相容性等特性成為表面增強拉曼光譜的候選材料，其與貴金屬如金、銀復合后表現出優異的SERS性能。TiN 的等離子體近場增強激發了其作為SERS基底的應用［10］，納米TiN 對吸附在其上的羅丹明R6G 的拉曼信號增強因子高達104［11］。劉燕梅等［12］通過制備貴金屬/氮化鈦復合薄膜對煙酸進行SERS檢測，測得其檢出限為10-5mol/L。Guler等［13］指出金納米粒子具有強大的光學性能，與氮化鈦結合可實現較好的SERS 效應。Ban 等［14］制備出TiN 與Ag 的納米球復合基底，通過等離子體共振協同作用提升SERS 性能，實現了對羅丹明R6G 分子的高靈敏和高穩定性檢測。裴媛等［15］將銀溶膠自組裝在Au/TiN 復合薄膜上，并對恩諾沙星進行了檢測。

使用貴金屬銀作為SERS 基底雖能達到相對較好的增強效果，但銀易氧化，會導致存放期間的SERS 能力降低。為了實現穩定性好的表面增強拉曼光譜檢測，通常利用金屬有機框架（Metal-organic framework，MOF）的熱穩定性及化學惰性防止銀的氧化變質并起到防護作用。Zhai等［16］制備了具有較高穩定性和檢測靈敏度的MOF-Au@Ag 復合SERS基底；Kim 等［17］深入研究了MOF對Ag納米線SERS特性的保護作用，發現復合MOF材料后即使在多種環境條件下儲存，Ag納米線仍能保持優異的SERS性能。此外，研究發現MOF具有孔隙多、表面積大和吸附能力強的特點，其高效吸附和富集能力有助于提升SERS基底的檢測靈敏度。

本文利用電化學陽極氧化結合氨氣還原氮化法制備出TiN 納米管陣列，通過電化學沉積法制備TiN-Ag 復合基底，并在該復合基底表面生長出MOF 保護層，得到MOF@TiN-Ag 復合基底，再復配銀溶膠，實現了對茶堿的SERS檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

D/MAX 2500PC 型X 射線衍射儀（XRD，日本理學株式會社）； S-4800 型場發射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）； JEM2800型透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）； Lambda 750S紫外-可見分光光度計（UV-Vis，美國Perkinelmer公司）；DXR型拉曼光譜儀（美國熱電公司）。

丙酮、異丙醇、N，N-二甲基甲酰胺、硝酸銀、檸檬酸三鈉、硝酸鈷、2-甲基咪唑均為分析純，購自上海阿拉丁試劑網；無水乙醇為分析純，購自天津市興復精細化工研究所；茶堿購自國藥集團化學試劑有限公司；高純氨氣（99.99%）和高純氮氣（99.99%）購自唐山市路北區萬嘉氣體公司。

1.2 實驗方法

本實驗制備流程圖如圖1所示。

圖1 MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底制備及其對茶堿SERS檢測的實驗流程圖Fig.1 Experimental flow chart of preparation of MOF@TiN-Ag/Ag sol composite substrate and SERS detection of theophylline

首先采用陽極氧化法和氨氣還原氮化法獲得TiN 納米管陣列結構，再利用電化學沉積技術在其表面沉積Ag 納米材料，在此基礎上，通過原位生長方式在TiN-Ag 表面形成MOF 保護層，得到MOF@TiN-Ag 復合SERS 基底。將茶堿配制成0.5 mol/L 的溶液，分別滴加在銀溶膠、MOF/銀溶膠、TiN/銀溶膠、MOF@TiN-Ag 以及MOF@TiN-Ag/銀溶膠基底上進行SERS 測試，后稀釋成一定濃度，測試SERS性能最強的MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底對茶堿的檢出限。

1.2.1 二氧化鈦納米管陣列的制備參照文獻［18］，將10 mm×20 mm 的鈦片依次放入丙酮、異丙醇和去離子水中超聲清洗10 min，接著置于體積比為1∶4∶5的HCl-HNO3-H2O的混合酸溶液中去除鈦片表面的氧化物，再用去離子水超聲清洗10 min，最后用乙醇溶液超聲清洗3 min，在空氣中自然晾干備用。以預處理后的鈦片為陽極，鉑片為陰極，電解液采用乙二醇-水-氟化銨體系（97 mL乙二醇、3 mL去離子水和0.446 g 氟化銨），兩極相距2 cm。直流穩壓電源設為60 V，氧化時間40 min，氧化溫度為室溫。氧化結束后將鈦片取出，用去離子水超聲5 min，以去除表面生成的雜質氧化物，80 ℃烘干后將其在空氣中預燒，以3 ℃/min的速率升至600 ℃，保溫2 h，得到TiO2納米管陣列。

1.2.2 還原氮化法制備氮化鈦納米管陣列將TiO2納米管陣列置于管式爐中進行氨氣還原氮化。先以5 ℃/min的速率升溫，并以80 mL/min 的速率向管式爐中通入N2至溫度為300 ℃，再以400 mL/min 的速率通入NH3至500 ℃，隨后將NH3流速調至800 mL/min 至溫度升至600 ℃，接著以1 ℃/min 升溫至800 ℃，保溫0.5 h，即制得TiN納米管陣列。

1.2.3 電化學沉積制備TiN-Ag 復合基底稱取0.033 8 g硝酸銀于燒杯中，加入40 mL去離子水使其完全溶解，再加入0.022 72 g檸檬酸三鈉，得到沉積液。以TiN納米管陣列基底為工作電極，鉑片為對電極（兩電極相距2 cm），采用恒電位模式沉積，電壓為2 V。沉積時間5 min 時取出，在空氣中自然晾干，即可制得TiN-Ag復合基底。

1.2.4 MOF@TiN-Ag 復合基底制備首先將2 mmol 硝酸鈷（0.582 g）溶于10 mL 甲醇制備出溶液A；再將16 mmol 2-甲基咪唑（1.313 6 g） 溶于10 mL 甲醇得到溶液B。將B 溶液迅速加入A 溶液中，劇烈攪拌，制得MOF 溶液，將上述TiN-Ag 復合基底浸入其中，反應0.5 h，用甲醇清洗3 次制得MOF@TiNAg復合基底。為進行對比，將TiN-Ag復合基底換成石英基片，重復上述操作得到MOF@石英基片。

1.2.5 MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底制備將藥物與銀溶膠以1∶1 體積混合后滴加在MOF@TiNAg 復合基底表面，即可制得MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底。其中，檸檬酸還原制備銀溶膠的過程［12］如下：稱取硝酸銀0.018 g 溶于100 mL 去離子水中，水浴加熱至沸騰，逐滴滴加2 mL 質量濃度為0.1 g/mL的檸檬酸三鈉溶液，100 ℃反應1 h，8 000 r/min離心10 min，去除上清液，即得納米銀溶膠。

1.3 SERS信號檢測

將茶堿溶于甲醇中配成0.5、0.1、5×10-2、1×10-2、5×10-3、1×10-3、5×10-4、1×10-4、5×10-5、1×10-5mol/L的茶堿溶液。對茶堿進行檢測時，激發波長為780 nm，激發功率為10 mW，采集時間為10 s，物鏡為10×。

2 結果與討論

2.1 銀溶膠制備及表征

采用透射電子顯微鏡對檸檬酸鈉還原合成的銀溶膠粒子形貌進行觀察，如圖2A所示，所合成的銀溶膠納米粒子呈類球形，其衍射環明顯，表明銀溶膠中含有金屬銀納米晶體。如圖2B、C 所示，銀溶膠納米粒子的晶格條紋間距為0.235 nm，對應單質銀晶體的（111）晶面。銀溶膠粒子的粒徑分布見圖2D，可見其粒徑主要集中在20～60 nm 之間。此外，銀溶膠的UV-Vis 圖譜在419 nm 波長附近出現了銀納米粒子的等離子體吸收峰，如圖2E所示。

圖2 銀溶膠的TEM透射電子顯微鏡圖（A～C）、粒徑分布圖（D）和UV-Vis圖譜（E）Fig.2 TEM images（A-C），particle size distribution（D） and UV-visible spectroscopy（E） of silver sol

2.2 復合基底組成與結構表征分析

圖3 為不同基底的X 射線衍射圖。可見，石英基片上滴加銀溶膠樣品的XRD 圖譜（圖3a）在38.2°處出現單質銀（111）晶面的特征衍射峰，證明石英基底表面存在銀納米粒子。對石英基片表面原位生長MOF 再滴加銀溶膠的基底進行XRD 分析，發現其在38.2°和64.6°處有單質銀的特征衍射峰，且衍射峰較強，并在12.32°、16.80°和17.90°處分別出現鈷基MOF（100）、（101）和（002）晶面的衍射峰，說明銀納米粒子和鈷基MOF 同時存在于石英基片上（圖3b）。圖3c 為TiN 基底上滴加銀溶膠樣品的XRD 圖譜，可知在2θ為36.9°、42.9°和62.5°處分別出現了NaCl 型面心立方結構TiN 晶體（111）、（200）和（220）晶面的特征衍射峰，2θ為38.2°處對應單質銀的（111）晶面，此外，還有少量金屬鈦的特征衍射峰。在MOF@TiN-Ag 復合基底的XRD 圖譜（圖3d）中，除了TiN 晶體（111）、（200）和（220）晶面和單質銀（111）晶面的特征衍射峰以外，在2θ為12.32°、16.80°和17.90°處出現了對應于鈷基MOF（100）、（101）和（002）晶面的特征衍射峰，說明樣品中存在TiN 晶體、單質銀和鈷基MOF 3 種物相，表明銀納米粒子和鈷基MOF同時存在于TiN納米管陣列上。由圖3e可知，在MOF@TiN-Ag復合基底上滴加銀溶膠后，該樣品的XRD 圖譜中存在TiN 晶體、單質銀和鈷基MOF的特征衍射峰，且銀單質的衍射峰強度相對較高，說明該復合基底中存在TiN 晶體、單質銀和鈷基MOF 3 種物相，且基底上金屬銀的相對含量較多。

圖3 不同基底的XRD圖譜Fig.3 XRD spectra of different substrates

圖4A為銀溶膠滴加在石英基片上的掃描電鏡圖，可以清晰地觀察到銀納米粒子呈球狀聚集，粒徑約為500 nm，部分粒子產生團簇現象，分布不均勻。在石英基片上生長MOF后再滴加銀溶膠，石英基片表面的MOF粒子形態規整、排列緊密且表面吸附了較多的銀納米粒子（圖4B）。在TiN 納米陣列基底表面滴加銀溶膠后，可以觀察到大量較為規整的TiN 納米管陣列，同時有銀納米粒子分布在其表面（圖4C）。圖4D 為MOF@TiN-Ag 基底的掃描電鏡圖，其中TiN 納米管陣列排列整齊，單質銀呈樹枝狀分布在TiN 納米管陣列表面，MOF 粒子呈團簇狀分散在復合基底表面。在MOF@TiN-Ag 復合基底上滴加銀溶膠后，團聚的MOF 粒子表面吸附了大量的銀納米粒子，銀納米粒子沿其表面輪廓分布，并覆蓋在TiN納米管陣列表面（圖4E）。對該樣品進行能譜掃描，結果如圖4F所示，復合基底表面分布有Ti、N、Ag、Co、C、O元素，其中Co元素來源于MOF中的鈷，TiN中含有Ti、N，MOF中的咪唑環也含有一部分N、C、O元素。以上進一步印證了XRD 的檢測結果，證明復合基底中存在TiN、單質銀和MOF納米粒子。

圖4 銀溶膠（A），MOF@銀溶膠基底（B），TiN/銀溶膠基底（C），MOF@TiN-Ag基底（D）和 MOF@TiN-Ag/銀溶膠基底（E）的SEM圖以及 MOF@TiN-Ag/銀溶膠基底的能譜圖（EDS）（F）Fig.4 SEM images of Ag sol（A），MOF@ Ag sol substrate（B），TiN/Ag sol substrate（C），MOF@TiN-Ag substrate（D），MOF@TiN-Ag/Ag sol substrate（E） and EDS spectrum of MOF@TiN-Ag/Ag sol substrate（F）

2.3 理論計算

利用Gaussian 軟件，并通過密度泛函理論（DFT）優化計算茶堿的理論拉曼圖譜。圖5A 為高斯軟件優化后的茶堿分子結構圖，圖5B為茶堿理論計算拉曼圖譜，通過查閱文獻和DFT計算得到的茶堿拉曼具體峰歸屬見表1。茶堿在497、562、681、799、977 cm-1處的理論拉曼位移來自茶堿嘧啶和咪唑環的伸縮振動；1 164 cm-1處為C—N 的伸縮振動、CH3和CH 的彎曲振動，1 262 cm-1處為C—N 的對稱伸縮振動和C=C 的伸縮振動，1 363 cm-1處對應CH3的彎曲振動，1 600 cm-1處為C=C 和C—N 的拉伸振動，1 645 cm-1處為C=O 的拉伸振動［19-21］。其中，文獻中的部分拉曼位移與DFT 理論計算結果有一定差別，例如，445、518、940、1 076、1 309、1 439、1 526 cm-1等。圖5C 為茶堿粉體的拉曼圖譜，由圖可知，茶堿粉體自身的拉曼響應較弱，僅在799、1 028、1 590 cm-1處出現特征拉曼峰。

表1 茶堿主要譜帶的理論拉曼位移和振動歸屬Table 1 Theoretical Raman shifts and vibrational assignments of theophylline major bands

圖5 DFT優化的茶堿結構（A）、茶堿的DFT計算拉曼圖譜（B）及茶堿粉體的拉曼圖譜（C）Fig.5 DFT optimized theophylline structure（A），DFT calculated Raman spectrum of theophylline（B） and Raman spectrum of theophylline powder（C）

2.4 復合基底對茶堿的SERS檢測

由于茶堿本身的拉曼響應較差，故將茶堿配制成0.5 mol/L，與銀溶膠以1∶1體積混合后分別滴加在石英基片、生長了MOF 的石英基片、TiN 基底、MOF@TiN-Ag 復合基底上進行拉曼檢測，為進行對比，將未與銀溶膠混合的茶堿單獨滴加在MOF@TiN-Ag復合基底上進行SERS檢測。茶堿在上述5種基底上的SERS圖譜見圖6A，拉曼信號強度的柱狀圖如圖6B所示。

圖6 茶堿溶液在不同基底上的SERS圖譜（A）及其拉曼檢測強度柱狀圖（B）Fig.6 SERS spectra of theophylline solution on different substrates（A） and their Raman detection intensity（B）

由圖可知，相比較于僅滴加銀溶膠的石英基片，在基片上生長MOF后再滴加銀溶膠可提高茶堿的拉曼響應，這是因為，MOF較強的吸附能力可將銀納米粒子聚集在石英基片表面，形成更多SERS“熱點”，因此在基底表面生長MOF 有助于銀溶膠的捕獲和分散。TiN/銀溶膠復合基底對茶堿溶液的SERS響應程度明顯高于銀溶膠，這得益于TiN 與金屬銀結合后的電磁場耦合增加了“熱點”的數量，同時兩者間的電荷轉移效應也使得基底的拉曼檢測性能增強［22］。而MOF@TiN-Ag 復合基底對茶堿具有更強的SERS 性能。在此基礎上，采用銀溶膠與茶堿（體積比1∶1）復合滴加的方式，將銀溶膠與茶堿的混合物滴加在MOF@TiN-Ag 復合基底表面，發現相比于前4 種基底，MOF@TiN-Ag/銀溶膠基底對茶堿具有最強的表面增強拉曼響應，位于544、1 265、1 548 cm-1處特征峰的響應最高，且無明顯熒光背底干擾。推測其原因可能是MOF 的多孔結構吸附能力強，可將銀粒子較為均勻地吸附聚集在TiN-Ag 基底表面，吸附的銀粒子與TiN-Ag基底之間更容易發生協同耦合效應，增加“熱點”數量，從而使基底的SERS性能提升［23-24］。因此，相比于文獻［19-20］采用100 mV 甚至更高功率的激光器，本文使用10 mV 的激光器，將藥物溶液與銀溶膠以1∶1體積比混合滴加在MOF@TiN-Ag復合基底上，利用復合基底的協同耦合效應，即可獲得較為優異的SERS性能。

將茶堿配成0.5、0.1、5×10-2、1×10-2、5×10-3、1×10-3、5×10-4、1×10-4、5×10-5、1×10-5mol/L 的溶液，分別與銀溶膠按1∶1體積比混合后滴加在MOF@TiN-Ag復合基底上進行拉曼測試。結果顯示，隨著茶堿溶液濃度的降低，基底上茶堿的信號強度逐漸降低。當茶堿濃度為1×10-5mol/L時，拉曼信號峰仍尖銳、清晰可見（圖7A），此時544 cm-1處峰的拉曼強度為432 cps，表明以MOF@TiN-Ag/銀溶膠為基底，茶堿的檢出限可達1×10-5mol/L。不同濃度的茶堿溶液在544 cm-1處的拉曼信號強度如圖7B 所示。以茶堿的濃度對數（X）與不同濃度下其在544 cm-1處的拉曼峰強度對數（Y）進行線性回歸，得到線性方程Y=3.114+0.098X，r2=0.956 4。以544 cm-1處的SERS 強度對MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底進行增強因子（EF）計算，計算公式［25］為EF =(ISERS/cSERS)/(Iref/cref)。其中，ISERS和cSERS分別表示茶堿溶液吸附在MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底上的SERS信號強度和濃度，Iref和cref分別表示茶堿溶液非SERS檢測的拉曼散射強度與濃度。當cSERS為1×10-5mol/L，cref為0.5 mol/L 時，MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底的EF 為1.08×106。

圖7 不同濃度茶堿吸附在MOF@TiN-Ag/銀溶膠基底上的SERS圖（A）與不同濃度茶堿在544 cm-1處的拉曼強度（B）Fig.7 SERS spectra of different concentrations of theophylline adsorbed on MOF@TiN-Ag/Ag sol substrate（A） and Raman strength of different concentrations of theophylline at 544 cm-1（B）

2.5 MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底檢測茶堿的SERS效應機理

由Gaussian 軟件計算得到茶堿的最高占據分子軌道（HOMO）能級為-6.28 eV，最低未占分子軌道（LUMO）能級為-1.19 eV。文獻顯示［26］，TiN 的禁帶寬度為2.73 eV，其VB 能量值為-7.17 eV，ECB為-4.44 eV。功函數為真空能級與費米能級之差［27］，TiN 的功函數為4.67 eV，Ag 納米粒子的功函數為4.10 eV，TiN 與Ag 復合后的功函數為4.54 eV［28］。如圖8 所示，TiN 與Ag 之間容易進行電荷轉移至二者的軌道能級差相同。在TiN-Ag 界面產生的電荷累積，使得茶堿與該復合基底之間存在電荷轉移機制，在780 nm 波長（1.63 eV）激光激發下，茶堿分子HOMO 軌道中的電子會向LUMO 軌道方向移動，產生的共振可有效增大體系極化率，使茶堿的拉曼信號增強，這也解釋了單獨使用銀溶膠對茶堿進行SERS檢測結果不理想的原因。

圖8 TiN-Ag/銀溶膠基底與茶堿的能級結構示意圖Fig.8 Schematic diagram of energy level structure of TiN-Ag/Ag sol and theophylline

基底電磁場的增強因子大致與局域電場增強的四次方成正比，電磁強度是探測區域內熱點獲得的拉曼信號的總量，即取決于“熱點”的數量和局域電磁場的強度［29-33］。為了更好地理解MOF@TiN-Ag/銀溶膠對茶堿分子SERS的影響，利用時域有限分差法（FDTD）對基底進行電場強度模擬，探究TiN-Ag與TiN-Ag/銀溶膠兩種復合基底的電場分布情況，如圖9 所示。可以看出，與單純的TiN-Ag 復合基底局域電場相比，TiN-Ag/銀溶膠基底局域電場強度相對較強，這是由于在MOF 的富集作用下，引入的銀溶膠被富集形成聚集的Ag納米粒子，其納米間隙具有較強的局域電場；同時，銀溶膠與TiN 基底也可形成耦合效應，使得TiN-Ag/銀溶膠復合基底 “熱點”的數量和大小均增多，局域表面等離子體共振引起的電場增強，從而賦予該基底更好的SERS 性能，這揭示了相比于其他4 類SERS 基底，采用MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底可以獲得藥物茶堿分子較強拉曼響應的物理機制［34］。

圖9 不同基底的2D-FDTD模擬圖Fig.9 2D-FDTD simulation of different substrates

2.6 實際樣品測定

在空白的中成藥枇杷露中添加茶堿，將0.5 mL 枇杷露與0.5 mL 銀膠溶液混合均勻后，滴加至MOF@TiN-Ag 復合基底上進行SERS 檢測。如圖10 所示，在位移為752 cm-1及1 151 cm-1處出現了歸屬于枇杷露的特征峰。將20、40、80 mg/mL 的茶堿添加到枇杷露中，滴加至MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底上，茶堿在544 cm-1處的特征峰可以被清楚指認，表明利用表面增強拉曼光譜技術可以對藥物的摻偽進行快速檢測。

3 結 論

本文采用電化學陽極氧化法結合氨氣還原氮化法制備出TiN 納米管陣列，隨后通過電化學沉積法制備出性能優異的TiN-Ag 復合基底，進一步在其表面生長MOF 納米粒子并滴加銀溶膠制得MOF@Ag-TiN/銀溶膠復合基底。該復合基底中，TiN、Ag 和MOF 3 種物相共存，單質銀呈樹枝狀均勻分布在TiN 納米管陣列表面，且MOF納米粒子也形成分子層覆蓋在TiN-Ag 復合基底表面，同時MOF 的強吸附能力將銀膠粒子聚集在TiN-Ag 基底表面形成更多“熱點”，而TiN-銀-茶堿之間的電荷轉移，增強了基底的SERS 性能。利用MOF@TiN-Ag/銀溶膠復合基底對茶堿進行拉曼檢測，檢出限為1×10-5mol/L。該方法在一定程度上拓寬了SERS技術在藥物檢測領域的應用。