錳/鋯-雙金屬有機骨架納米酶比色法檢測水中痕量氟

牟芝梅，鄧治臣，趙靜鑾，柳敬魚，丁芯茹，彭文洪，賀錦燦

（廣東藥科大學 公共衛生學院，廣東 廣州 510310）

氟是人體必需的微量元素之一，人體內的氟主要來源于飲水［1］。流行病學研究發現，適量的氟有促進生長發育、預防齲齒等作用［2］，但過量攝入則可導致氟斑牙、氟骨癥［3］，還會影響中樞神經系統、肌肉、心血管系統以及血液系統。因此需對存在于飲用水中的氟含量進行嚴格限制。采用地表水或地下水為生活飲用水水源時，氟離子（F-）的最大允許濃度為1.0 mg/L［4］。中國是地方性飲用水氟中毒流行最廣、危害最嚴重的國家之一，地方性氟中毒危及我國超過30個省（自治區）。據不完全統計，我國有此病的縣總數已超過一千個，受影響群眾達上億人［5］。因此，檢測和監管飲用水中氟離子含量，是保障人民飲用水安全的重要前提。

目前F-的檢測方法主要有離子選擇電極法、離子色譜法、熒光法、氣相色譜法等［6-7］。其中，比色法是通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。與其他分析方法相比，比色法不需要復雜的儀器，待測物預處理簡便、檢測成本低、方便快捷、操作簡單、不依賴專業人員，符合現場快速檢測的要求［8］。

金屬有機框架（Metal-organic frameworks，MOF）是一類由金屬中心和有機配體組裝而成的納米材料，具有比表面積與孔隙率高及孔隙結構可控的特點［9］，在儲氣、分離、傳感器、催化等方面［10-12］具有重要的應用。某些MOF 中含有的順磁性金屬，如鐵、銅、鈷、錳、鋯等，賦予了MOF 類過氧化物酶（納米酶）活性，與天然酶相比，MOF納米酶具有性質穩定、易于保存、成本低等優點。MOF納米酶可催化氧化無色的顯色底物（如3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺等）顯色，在比色檢測應用方面日益受到關注。例如，筆者所在課題組［13］設計了一種能選擇性識別磷酸根離子的鈷基MOF納米酶，并將其成功用于食品中磷酸鹽的比色檢測。Wu 等［14］發現鋯-氨基酸MOF 具有類過氧化物酶活性，但鋯基MOF 的類過氧化物酶活性較弱，通常需與其他金屬如鐵［15］、銅［16］、鈰［17］等協同以提高其納米酶活性。鋯基MOF除具有類過氧化物酶活性外，還具有選擇性吸附氟的能力。Zhao 等［18］發現，相較于MIL-53（Fe，Cr，Al）、MIL-68（Al）、CAU-1、CAU-6，UiO-66（Zr）展現出更強的氟離子吸附能力 ；Zhu 等［19］發現MOF-801（Zr）對水中的氟化物具有較強的選擇吸附作用。目前，鋯基MOF 大多用于氟化物的吸附研究，在氟的比色定量檢測方面鮮見報道。在各種過渡金屬中，錳因其低毒性、多用性、多價性而備受關注［20］。有研究者發現，通過摻雜金屬錳制備雙金屬催化劑，可以提高材料的催化活性［21］。因此，以鋯鹽和錳鹽為金屬前驅體，有望制備出一種對氟離子同時具有識別功能和比色檢測功能的雙金屬MOF。

基于以上考慮，本研究通過共沉淀法合成了新型Mn/Zr-MOF 材料，同時基于錳離子、鋯離子賦予該材料的類過氧化物酶活性及鋯離子對F-的選擇性識別作用，建立了一種靈敏、快速、高選擇性檢測F-的比色法，并應用于實際水樣中F-的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

xMark 酶標儀（美國 Bio-Rad 公司）；Hitachi S4800 掃描電子顯微鏡（SEM，日本 Hitachi 公司）；EscaLab 250Xi X 射線衍射儀（XRD，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Axis Ultra DLD Kratos AXIS SUPRA X 射線光電子能譜儀（XPS，日本島津公司）；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Bruker E580 順磁共振波譜儀（ESR，德國Bruker 公司）；UV-3010 紫外-可見分光光度計（日本日立公司）；FA 1204 B 電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；H3-18K 高速離心機（湖南可成儀器有限公司）；DF-101S磁力攪拌器（河南鞏義予華儀器有限責任公司）；YC-S30恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；LGJ-10C冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）。

1.2 試劑與耗材

3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB）、2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、鄰苯二胺（OPD）、均苯三甲酸、氟化鈉、氯化鋯、無水乙醇均購自阿拉丁試劑有限公司；一水合硫酸錳、醋酸和無水醋酸鈉購自廣州化學試劑廠；過氧化氫（H2O2）購自江西健寶醫藥科技有限公司。所有化學試劑至少為分析純，使用時無需進一步純化。實驗用水為超純水（＞18.2 MΩ?cm）。醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（HAc-NaAc，pH 4.8）由醋酸和無水醋酸鈉按照一定比例配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 Mn/Zr-MOF的制備與表征 采用一鍋共沉淀法制備Mn/Zr-MOF：配制20 mmol/L 均苯三甲酸溶液、系列不同濃度的氯化鋯溶液（15、20、30、40、45、50 mmol/L）和一水合硫酸錳溶液（10、15、20、30、40、45 mmol/L）。向500 mL 三頸燒瓶中分別加入100 mL 的20 mmol/L 均苯三甲酸、100 mL 氯化鋯溶液、100 mL一水合硫酸錳溶液（控制金屬鹽溶液總濃度為60 mmol/L，依次調整鋯鹽/錳鹽的加入濃度比為1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1、5∶1）。將混合溶液于25 ℃下磁力攪拌反應1 h，待溶液顏色由澄清轉變成乳白色，將所獲得的乳白色濁液于8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用超純水洗滌兩次，冷凍干燥12 h，得到6種不同錳、鋯摻雜比的白色Mn/Zr-MOF材料。

通過 SEM、XPS、FTIR、XRD 等技術對Mn/Zr-MOF的形貌、元素、官能團、晶體結構進行表征。

1.3.2 分析方法將1 mL pH 4.8的HAc-NaAc緩沖溶液、1 mL 1.3 mg/L的Mn/Zr-MOF材料、一系列濃度梯度的氟化鈉標準溶液、0.8 mL 2.0 mmol/L的TMB溶液和0.04 mL 0.997 mol/L的H2O2溶液依次加入5 mL 比色管中，使用HAc-NaAc 緩沖溶液定容至刻度，30 ℃孵育15 min。用紫外-可見分光光度計采集體系的吸收光譜圖，并記錄652 nm處的吸光度值。以不加Mn/Zr-MOF材料的體系作為對照組，實驗組和對照組均平行測定3次，其吸光度平均值分別作為A和A0，計算二者差值ΔA（A0-A）。

1.3.3 樣品處理取廣州市龍潭涌河流水和當地超市所購買的純凈水各15 mL，經0.22 μm 微孔濾膜過濾及陽離子交換樹脂后按照“1.3.2”進行分析。

1.4 數據處理

采用Origin 2022進行數據處理與分析。

2 結果與討論

2.1 分析原理

方法的分析原理如圖1 所示，Mn/Zr-MOF 具有類過氧化物酶活性，能夠促進H2O2的降解反應并產生高活性的羥基自由基（?OH），這些具有強氧化性的?OH 能進一步氧化TMB 生成oxTMB，使體系呈藍綠色。當反應體系中存在F-時，Mn/Zr-MOF 與F-特異性結合，占據了Mn/Zr-MOF 部分活性位點，使得Mn/Zr-MOF 的催化活性受到抑制，體系產生的?OH 較少，顏色變淺。顏色的深淺與F-的濃度相關，基于此原理可建立檢測氟的Mn/Zr-MOF 納米酶比色分析方法。

圖1 錳/鋯-雙金屬有機骨架納米酶比色法檢測氟的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram for the principle of colorimetric detection of fluoride based on Mn/Zr-MOF nanoenzyme

2.2 Mn/Zr-MOF的制備與表征

通過一鍋共沉淀法制備了6 種不同鋯鹽/錳鹽摻雜濃度比（1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1、5∶1）的Mn/Zr-MOF 材料，比較這些材料催化過氧化氫氧化TMB 的效果，結果如圖2 所示。結果顯示，鋯鹽和錳鹽摻雜比為3∶1 的Mn/Zr-MOF 材料催化活性最強，因此采用鋯鹽/錳鹽摻雜濃度比為3∶1合成的Mn/Zr-MOF 材料進行后續表征和分析應用。

圖2 不同鋯鹽/錳鹽摻雜比合成的Mn/Zr-MOF材料用于催化H2O2-TMB反應所獲得的652 nm處的吸光度Fig.2 The absorbance at 652 nm obtained from the system of H2O2-TMB catalyzed by Mn/Zr-MOF with different doping ratios of zirconium/manganese salts

SEM 圖（圖3A）顯示Mn/Zr-MOF 為不規則的塊狀結構。用XPS 驗證Mn/Zr-MOF 的組成，結果如圖3B 所示。Mn/Zr-MOF 中存在 Zr 3d、C 1s、N 1s、O 1s、Mn 2p 的峰，插圖顯示，材料中同時存在 Mn2+、Mn3+。通過FITR 分析材料的官能團（圖3C），3 472、1 652 、1 367、471 cm-1處分別歸屬于—OH、C＝O、C—O—C、Ar—H 的伸縮振動；660 cm-1處的峰可歸屬為Zr—O、Mn—O 的伸縮振動［22］。采用XRD 表征Mn/Zr-MOF 的晶型結構（圖3D），發現Mn/Zr-MOF 的結晶度較差，在40.46°、45.1°和51.4°處的衍射峰分別與模擬Mn-MOF 的（200）、（202）和（108）晶面對應；在8.3°和8.6°處的衍射峰分別與模擬MOF-808（Zr）的（311）和（222）晶面一致。上述結果表明，Mn-Zr/MOF成功合成。

圖3 Mn/Zr-MOF的SEM圖（A），XPS圖（B），FTIR圖（C）以及Mn/Zr-MOF的XRD譜圖與Mn-MOF、MOF-808（Zr）的XRD模擬譜圖（D）Fig.3 SEM image（A），XPS curve（B），FTIR spectrum（C） of Mn/Zr-MOF，and XRD spectrum of Mn/Zr-MOF，and simulation spectra of Mn-MOF and MOF-808（Zr）（D）

2.3 反應條件優化

酶的活性受pH 值和溫度的影響最大，因此考察了pH 值（3.5、4.0、4.5、4.8、5.0、5.3）和溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）對吸光度的影響。結果顯示，隨著pH 值的升高，Mn/Zr-MOF 的催化活性先升高后降低，在pH 4.8時催化活性達到最高；而隨著反應溫度的升高，Mn/Zr-MOF 的催化活性先增加后降低，在30 ℃時達到峰值，過高或過低的溫度均會影響Mn/Zr-MOF活性進而影響催化活性。此外，為了發揮反應體系的最大檢測效能，本研究還對MOF 材料濃度、TMB 濃度、過氧化氫濃度、孵育時間進行了優化。

最終確定的最優反應條件為：1 mL 1.3 mg/L的MOF 材料、0.8 mL 2.0 mmol/L 的TMB、0.04 mL 0.997 mol/L 的過氧化氫、pH 4.8、溫度30 ℃、反應時間15 min。

2.4 Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性研究

以TMB、ABTS、OPD 為底物，研究Mn/Zr-MOF 的類過氧化物酶活性。如圖4 所示，TMB、ABTS、OPD 溶液均無明顯特征吸收峰，而在含有TMB和H2O2的NaAc-HAc緩沖溶液中加Mn/Zr-MOF，溶液由無色變成藍色，且TMB-H2O2-Mn/Zr-MOF 體系在652 nm 處有較強的吸收峰。此外，Mn/Zr-MOF 也能催化ABTS 和OPD 顯色。該結果說明Mn/Zr-MOF具有類過氧化物酶活性。

圖4 3種底物（TMB、ABTS、OPD）被Mn/Zr-MOF催化氧化前后的吸收光譜圖Fig.4 The absorption spectra of three substrates（TMB，ABTS，OPD） before and after catalytic oxidation by Mn/Zr-MOF insert：the chart of color change

以TMB和H2O2為底物，進一步研究Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性，進行穩態動力學評價：在反應體系最適的pH 值和溫度下，改變其中一種底物濃度，在652 nm 波長下進行40 min穩態動力學掃描，得到典型的Michaelis-Menten 曲線（圖5），根據Michaelis 方程計算出米氏常數（Km）和最大反應速度（Vmax）。Mn/Zr-MOF以TMB和H2O2為底物的Km分別為0.75、4.23 mmol/L，Vmax分別為186.92×10-8、85×10-8mol/（L?s）；在相同的實驗條件下，測得辣根過氧化物酶（HRP）以TMB 和H2O2為底物的Km分別為0.74、0.65 mmol/L，Vmax分別為10.60×10-8、3.40×10-8mol/（L?s）。Mn/Zr-MOF 以H2O2為底物的Km值大約是HRP的6倍，說明Mn/Zr-MOF需要較高的H2O2濃度才能獲得最大活性。以TMB為底物時，Mn/Zr-MOF 具有與HRP 相當的TMB 親和力。此外，Mn/Zr-MOF 的Vmax大于HRP。Mn/Zr-MOF 以TMB 為底物的Km值稍低于MoS2@MgFe2O4［23］和Fe-Ag2S［24］，Vmax是MoS2@MgFe2O4的2倍，Fe-Ag2S的12倍。上述數據表明，與其他納米酶相比，Mn/Zr-MOF的反應速率較快，表現出較好的催化活性。

圖5 底物TMB濃度（A）和H2O2 濃度（B）對Mn/Zr-MOF催化反應速率的影響Fig.5 Effect of TMB concentrations（A） and H2O2 concentrations（B） on the rate of catalytic reaction of Mn/Zr-MOF insert：double reciprocal plot

2.5 氟離子對Mn/Zr-MOF類過氧化物酶活性的影響

通過比較Mn/Zr-MOF 在F-存在/不存在以及不同存在濃度時反應體系光譜的變化，考察F-對Mn/Zr-MOF 類過氧化物酶活性的影響。如圖6A 所示，TMB 溶液無特征吸收峰；TMB-H2O2-Mn/Zr-MOF 體系在652 nm 處有較強吸收峰，說明Mn/Zr-MOF 具有類過氧化物酶活性；當加入F-后，反應體系的吸光度明顯降低；隨著F-質量濃度的增加，反應體系的吸光度逐漸降低，說明F-抑制了Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性。以5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）為?OH 的捕獲劑，通過ESR 表征考察F-對Mn/Zr-MOF 催化活性的影響（圖6B）。當體系中不存在F-時，可以觀察到顯著的?OH 特征信號，表明Mn/Zr-MOF 能夠催化H2O2，并產生高活性的?OH；當體系中存在F-時，ESR 峰值顯著降低，說明生成的?OH減少。這一結果證明F-的吸附引起?OH的生成量減少，導致Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性降低。通過對比加入F-前后O 1s（圖6C）和Zr 3d（圖6D）的XPS 圖，發現F-存在時，Zr-OH 峰面積所占的百分比降低，Zr 3d 向較低結合能區域輕微移動。表明F-吸附在Mn/Zr-MOF 上時，與Zr-OH 發生離子交換，說明Zr與F-存在特異性識別作用。

圖6 不同體系的吸收光譜圖（A），F- 加入Mn/Zr-MOF催化體系前后的ESR圖譜（B）及Mn/Zr-MOF的O 1s（C）、Zr 3d（D）XPS光譜圖Fig.6 The absorption spectra of different systems（A），the ESR curves of Mn/Zr-MOF-involved catalytic system before and after the addition of fluoride ions（B），the XPS spectra of O 1s（C） and Zr 3d（D） of Mn/Zr-MOF

2.6 方法建立

在上述優化的催化反應條件下進行實驗，發現隨著F-濃度的增大體系的顏色逐漸變淺，652 nm 處的吸光度逐漸降低，以F-質量濃度（ρ）為橫坐標，ΔA為縱坐標進行線性擬合。結果顯示，在0.40～5.0 mg/L范圍內，F-質量濃度與ΔA線性相關，線性方程為ΔA=0.065 12ρ+0.751 17，相關系數（r）為0.999 6，以信噪比（S/N）為3計算得到檢出限（LOD）為0.16 mg/L，低于國標飲用水中F-的準則值（1.0 mg/L）。與NH2-UiO-66 熒光法［25］、鎳-吡咯苯并咪唑絡合物比色法［26］和季胺型熒光探針法［27］相比（表1），本方法的檢出限更低；盡管Ni-POCOP 探針比色法［28］比本方法的檢出限更具優勢，但Ni-POCOP 探針合成需要8 h，且使用有毒有機溶劑乙腈，而本方法中Mn/Zr-MOF 材料的合成只需1 h，溶劑為水，避免了有毒有害有機溶劑的使用。

表1 不同F- 檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for detection of F-

2.7 選擇性分析

考察了18種水樣中可能存在的陰、陽離子對體系檢測2.0 mg/L F-的影響，結果如表2所示。大多數無機陰離子、無機陽離子對F-檢測的影響較小，相對誤差小于±7.0%。部分金屬離子（如Tb3+、Ag+）的耐受倍數低，說明可能存在一定的干擾，可在樣品檢測前通過陽離子交換樹脂去除。總體來說，該方法對F-具有較好的選擇性。

表2 不同共存離子對檢測體系的影響（n= 3）Table 2 The effect of different coexisting ions on detection system（n=3）

2.8 實際樣品分析

將所建立的方法應用于河流水、純凈水實際樣品中F-的測定，結果在河流水中檢出0.86 mg/L 的F-，純凈水中未檢出。將本方法與國家標準方法（氟離子選擇電極法）［29］進行比對，T檢驗顯示兩種方法的檢測結果無顯著性差異（P＞ 0.05）。對樣品進行3 個水平的加標回收實驗，得到加標回收率為97.6%～106%，相對標準偏差（RSD）為0.27%～5.2%（n=3），見表3。上述結果說明本方法具有較好的準確性及精密度，滿足實際水樣中氟的檢測要求。

表3 實際水樣中氟離子的測定（n=3）Table 3 Determination of fluoride ions in different water samples（n=3）

3 結 論

本文設計合成了一種新型Mn/Zr-MOF 納米材料，并基于其類過氧化物酶活性及對F-的選擇性識別作用，建立了一種檢測F-的催化比色法。方法的線性范圍為0.40～5.0 mg/L，檢出限為0.16 mg/L。將該方法應用于實際水樣中F-測定，加標回收率為97.6%～106%，RSD 為0.27%～5.2%，檢測結果與國標法一致。本方法檢測速度較快、特異性好、靈敏度高，在實際樣品檢測中有較好的適用性，有望進一步制成試劑盒、試紙條，與手機拍照識色功能結合進行定量分析，以更好地滿足現場檢測需求。此外，還可通過Mn/Zr-MOF 上金屬離子的變更及官能團的修飾，實現不同待測物的特異性結合，開發其他分析物的比色檢測方法或進一步拓展不同的檢測模式。