血清lncRNA NEAT1在急性心肌梗死患者中的表達及其臨床意義

趙 沱 白鵬飛 孫 婧 程 濤

（長安醫院心血管內科，陜西 西安 710016）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是常見的心血管疾病，由動脈粥樣硬化引起冠狀動脈管腔閉塞和斑塊破裂導致[1]。AMI起病急、病情危重，對于AMI的早期診斷尤為重要，臨床常用心肌酶譜[肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）]和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）診斷AMI[2]。但cTnI和CK-MB升高還與其他原因導致心肌細胞損傷或細胞通透性增加有關，并且上述心肌細胞損傷標志物檢測受多種因素的影響[3]。因此，有必要尋找新的AMI分子標志物。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種不能編碼蛋白質、長度≥200 nt的長鏈RNA，可在轉錄后水平調控細胞生物學行為[4]。核富集轉錄體 1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）是近年來發現的lncRNA，已有研究發現心力衰竭合并肺部感染患者血清lncRNA NEAT1表達顯著升高[5]，干擾lncRNA NEAT1表達能減輕缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激損傷和心肌細胞凋亡[6]，提示lncRNA NEAT1在心肌相關疾病中起重要作用。本研究擬探討lncRNA NEAT1在AMI診斷中的價值，及其與心肌酶譜的相關性，為臨床診斷和治療AMI提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年6月—2020年12月長安醫院AMI患者77例（AMI組）、不穩定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）患者70例（疾病對照組）、體檢健康者76名（正常對照組）。

AMI納入標準：1）符合AMI診斷標準[7]；2）入院時發病時間≤24 h；3）入院前未接受過心肌梗死治療；4）臨床資料完整。排除標準：1）合并嚴重肝、腎、肺功能障礙；2）合并惡性腫瘤；3）近期使用過免疫抑制劑或存在嚴重免疫功能缺陷；4）合并嚴重血液傳染性疾??；5）合并先天性心臟病或嚴重心律失常；6）合并精神疾病。UAP患者符合《不穩定型心絞痛中醫診療專家共識》[8]中的診斷標準。排除標準：1）合并嚴重的肝、腎功能衰竭；2）合并精神疾病。本研究經長安醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

收集所有研究對象的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、血脂情況等。

1.2.2 lncRNA NEAT1相對表達量檢測

采集AMI和UAP患者入院時、正常對照者體檢當日空腹靜脈血5 mL，3 000×g離心10 min，分離血清。采用TRIzol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取血清總RNA，將總RNA溶于10 μL超純水，測定RNA的濃度和純度，以1.7

以cDNA為模板，采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）和SYBR Green PCR試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]檢測lncRNA NEAT1相對表達量，檢測方法為實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR），以GAPDH為內參。反應體系：共10 μL，其中SYBR Green Mix 5.0 μL，PCR F Primer 0.2 μL，PCR R Primer 0.2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 2.6 μL。引物序列：lncRNA NEAT1上游引物為5'-GGATGATGCAAACAATTACTG-3'，下游引物為5'-TCCACCTACACACCCAC-3'；GAPDH上游引物為5'-GATGGCTAGTCGTAGCATCG-3'，下游引物為5'-AGCTGGCATGCCCGATCGATC-3'。引物設計和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，35個循環。實驗設置5個復孔。采用2-ΔΔCt計算lncRNA NEAT1相對表達量。

1.2.3 心肌酶譜和cTnI水平檢測

采用酶聯免疫吸附試驗檢測cTnI，試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司。采用DXC600全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）和配套試劑檢測CK、CK-MB、LDH和AST水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0和Origin 9.1軟件進行統計分析。采用K-S檢驗評估計量資料的正態性。呈正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示，多組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。計數資料采用例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估lncRNA NEAT1相對表達量診斷AMI的效能。采用Pearson或Spearman相關分析評估lncRNA NEAT1相對表達量與血清心肌酶譜和cTnI的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組之間臨床資料比較

3組之間年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史、高血脂等臨床資料差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 3組之間臨床資料比較

2.2 正常對照組、疾病對照組和AMI組lncRNA NEAT1相對表達量比較

正常對照組、疾病對照組和AMI組血清lncRNA NEAT1相對表達量分別為1.04±0.23、1.76±0.35、2.54±0.47。3組之間血清lncRNA NEAT1相對表達量差異有統計學意義（F=17.461，P<0.001）。見圖1。

圖1 3組lncRNA NEAT1相對表達量比較

2.3 正常對照組、疾病對照組和AMI組血清心肌酶譜和cTnI水平比較

與正常對照組和疾病對照組比較，AMI組cTnI、CK、CK-MB、LDH、AST水平升高（P<0.05）。與正常對照組比較，疾病對照組cTnI、CK、CK-MB、LDH、AST水平升高（P<0.05）。見表2。

表2 正常對照組、疾病對照組和AMI組血清心肌酶譜和cTnI水平比較

2.4 lncRNA NEAT1相對表達量診斷AMI的效能

ROC曲線分析結果顯示，lncRNA NEAT1診斷AMI的曲線下面積（95%可信區間）為0.825（0.754～0.895），最佳臨界值為1.595，Youden指數為0.582，敏感性為77.9%，特異性為80.3%；鑒別診斷AMI和UAP的曲線下面積（95%可信區間）為0.759（0.680～0.838），最佳臨界值為1.385，Youden指數為0.478，敏感性為67.5%，特異性為78.3%。見圖2、圖3。

圖2 lncRNA NEAT1相對表達量診斷AMI的ROC曲線

2.5 lncRNA NEAT1相對表達量與心肌酶譜和cTnI水平的相關性

Spearman相關分析和Pearson相關分析結果顯示，lncRNA NEAT1相對表達量與CK、CKMB、LDH、AST和cTnI水平均呈正相關（r值分別為3.081、3.772、2.915、3.004、4.021，P<0.05）。

3 討論

近年來，越來越多的證據表明lncRNA在心肌損傷中具有重要作用。動物實驗結果顯示，在心肌缺血再灌注損傷小鼠模型中，lncRNA NEAT1呈高表達，高水平的lncRNA NEAT1會促進心肌損傷，敲低lncRNA NEAT1可減輕心肌缺血再灌注損傷[10]。有研究結果顯示，lncRNA NEAT1下調可顯著抑制LDH、丙二醛、活性氧和內質網應激調節的心肌細胞凋亡[11-12]。由此可見，高表達的lncRNA NEATI與心肌損傷密切相關。郭俊等[13]的研究結果顯示，老年AMI患者外周血lncRNA NEAT1表達顯著上調，對AMI的早期診斷有一定的價值。CHEN等[14]的研究結果顯示，血清外泌體lncRNA NEAT1是診斷急性ST段抬高型心肌梗死的有效生物標志物，與本研究結果一致。本研究結果顯示，AMI患者血清lncRNA NEATI相對表達量顯著高于疾病對照組和正常對照組（P<0.05）；ROC曲線分析結果顯示，lncRNA NEAT1診斷AMI的曲線下面積為0.825，可作為診斷AMI潛在的分子標志物。

心肌酶譜和cTnI是常用的AMI診斷指標，AMI患者心肌酶譜和cTnI水平顯著升高[15-16]。本研究Spearman相關分析和Pearson相關分析結果顯示，lncRNA NEAT1相對表達量與CK、CK-MB、LDH、AST和cTnI均呈正相關（r值分別為3.081、3.772、2.915、3.004、4.021，P<0.05）。cTnI和CK-MB等生物標志物的定量檢測可能會受抗凝劑使用等多種因素的影響，導致檢測結果出現偏差，且cTnI一般是在AMI發生6 h后才出現升高，可能會導致漏診等情況發生，降低了臨床診斷效率[17]。因此，多種血清生物標志物的聯合檢測或可提高AMI早期診斷的準確性。

綜上所述，AMI患者血清lncRNA NEAT1相對表達量顯著升高，且與心肌酶譜和cTnI水平呈正相關，或可作為AMI潛在的生物標志物。