基于網絡藥理學和分子對接技術探討香藿噴霧劑治療新冠肺炎的作用機制

曹悅 林瑞超 董汛 張柏娥 楊宏志

2019年末中國突發新型冠狀病毒肺炎(以下簡稱“新冠肺炎”),且病情發展迅速。本課題組基于前期對病毒性感冒、流行性感冒、咽炎、鼻炎等呼吸系統疾病的研究,結合新冠肺炎的臨床特征研制出一款復方中成藥制劑—香藿噴霧劑。其劑型為噴霧劑,該藥制劑工藝主要以提取揮發油入藥,既保留了傳統組方的療效,又具有使用便捷、藥物可直達病所等優點。2020年4月至5月期間,本課題組運用香藿噴霧劑治療新冠肺炎患者,結果顯示該藥能顯著改善患者癥狀,臨床總有效率達到了98.30%,同時具有良好的安全性[1]。

網絡藥理學是融合了生物學、藥理學、生物信息學等多學科技術和內容的新興學科,系統綜合地預測與分析復方藥物對疾病的影響,構建“藥物—靶點—疾病”網絡,探討可能存在的作用機制[2-3]。本文基于前期臨床研究結果,應用網絡藥理學對香藿噴霧劑的治療作用機制進行預測和分析,并為后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分篩選、治療靶點收集

香藿噴霧劑為云南省藥物研究所研發和生產,其藥物規格為每瓶 20 mL,每撳含廣藿香揮發油2.86 mg(相當于生藥材0.143 g)、香薷揮發油1.43 mg(相當于生藥材0.15 g)、艾葉揮發油1.43 mg(相當于生藥材0.37 g)、丁香揮發油0.714 mg(相當于生藥材0.017 g)和薄荷揮發油0.714 mg(相當于生藥材0.039 g)等。在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)中分別輸入基本藥方中的6味中藥名稱(廣藿香、蒼術、香薷、艾葉、丁香、薄荷),查找各自的有效化學成分,并依據口服生物利用度(oral bioavailability OB)和類藥性(drug-likeness,DL)兩個參數篩選目標成分,篩選條件為同時滿足OB≥30%,DL ≥0.10兩個條件,獲得香藿噴霧劑的活性成分。將所得化合物成分通過 TCMSP 數據庫進行成分的靶點獲取,通過Perl腳本, 結合UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫,標準化每種活性成分的藥物靶點,物種限于“智人”,并將靶蛋白轉化為相應的基因,同時匯總刪除重復項。將藥物、活性成分、靶點基因相對應,再將genesymbol與之對應。

1.2 疾病靶點篩選

在DisGeNET(https://www.disgenet.org)數據庫中以“Corona virus disease 2019”( 簡稱COVID-19)為關鍵詞進行檢索,設置Scoregda≥0.98進行篩選導出到Excel, 在GeneCards(https://www.genecards.org)數據庫中,Score值越高,表示該靶點與疾病關系越密切,若靶點過多則設定Score值大于中位數。分別將CTD(https://ctdbase.org/)以及PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)數據庫中得到的靶點基因導出, 輸入到UniProt數據庫中,校正基因,去除假陽性后,通過Excel對四個數據庫所得基因進行查重合并。

1.3 蛋白相互作用網絡構建

使用Venny[Venny2.1.0(csic.es)]繪制香藿噴霧劑活性成分與新冠肺炎相關靶點的韋恩圖。在“List1”欄內輸入有效活性成分的靶點,在“List2”欄內輸入新冠肺炎的相關靶點,得到韋恩圖及交集基因,交集基因即為香藿噴霧劑治療新冠肺炎的潛在靶點。將交集基因輸入String(https://cn.string-db.org/)數據庫,設定屬性為“人類”,置信度≥0.4,未連接的節點被隱藏,其余參數設置為默認值,得到蛋白相互作用網絡圖。其中節點代表蛋白質,邊代表蛋白質之間的關系,綠色邊表示基因鄰域,紅色邊代表基因融合,深藍色邊代表基因共生,黑色邊代表基因共表達。保存String的tsv文件,運用R(https://www．r-project．org/)軟件分析degree,并排序,選取分值靠前的基因作為關鍵靶點。

1.4 化合物—靶點網絡圖繪制

運用Cytoscape_v3.7.2繪制香藿噴霧劑治療新冠肺炎的“活性成分-靶點”網絡圖,將相應數據導入軟件中,以“節點”(node)代表活性分子和靶點基因,“邊”(edge)代表活性分子和靶點基因的相互關系。收集活性成分、靶點的連接度,得出關鍵活性成分和靶基因。

1.5 功能富集分析

將genesymbol轉換為entrezID,在R軟件中插入“colorspace”“DOSE”“pathview”“clusterProfiler”“stringi”包,運用R軟件按照富集的數量和顯著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05),對交集基因進行分析,取前20項畫出柱狀圖和點狀圖。

1.6 通路富集分析

引用1.5安裝的插件,運用R軟件按照富集的數目和顯著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05)進行分析,得到相應的通路圖,取前20項畫出柱狀圖和點狀圖。

1.7 分子對接

1.7.1 配體篩選 將獲得的活性成分以連接度來評價其活性強度,選取連接度靠前的化合物木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、山柰酚(kaempferol)作為分子對接的供體。先在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中查詢2D結構,用ChemBiodraw畫出其分子結構,將2D結構導入ChemBio3D軟件,轉化為3D結構,導入Autodocktools-1.5.6轉換為pdbqt格式進行保存。

1.7.2 蛋白受體準備 結合各分子的節點度選取雌激素受體1(estrogen receptor 1, ESR1)、白介素6 (interleukin 6, IL-6)、霉菌原癌基因蛋白(myc proto-oncogene protein,MYC)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1, HSP90AA1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、半胱氨酸蛋白8(Caspase 8, CASP8)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1 (serine/threonine kinase 1, Akt1)、半胱氨酸蛋白3(caspase 3, CASP3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)作為分子對接的靶點蛋白受體。將基因名輸入Uniprot數據庫,以ReviewedSwiss-prot和Human為條件進行過濾,獲得EntryID,將ID號輸入RCSBPDB(https://www.rcsb.org/)數據庫,下載蛋白受體的結構,將其導入PyMOL和Autodocktools-1.5.6進行去水,加氫,合并非急性氫等處理,轉換為pdbqt格式進行保存。

1.7.3 分子對接 運用Autodocktools-1.5.6的Grid功能確定活性口袋的位置,保存配置文件,運用Autodockvina1.1.2進行分子對接,得到各受體與供體的結合能。

2 結果

2.1 活性成分與靶點

在TCMSP數據庫中,以OB≥30%,DL≥0.1為條件進行篩選,得到“藿香”的活性成分28個,靶點基因172個;“香薷”活性成分18個,共有330個靶點;“蒼術”活性成分12個,有97個靶點;“艾葉”活性成分12個,共有83個靶點;“薄荷”活性成分13個,對應229個靶點;“丁香”活性成分11個,對應158個靶點。將靶點輸入UniProt數據庫進行校正,依據口服利用度選取前20項活性成分,見表1。

表1 香藿噴霧劑前20種活性成分

2.2 疾病靶點

在DisGeNET數據庫中以“COVID-19”為關鍵詞進行檢索,設置Scoregda≥0.98,篩選得到405個與新冠肺炎相關的基因。在Gencards數據庫中得到4585個相關基因。在CTD數據庫中得到9875個基因,在PharmGKB數據庫中得到9個基因,將4個數據庫所得基因輸入UniProt數據庫校正查重合并得到11673個基因。

2.3 蛋白相互作用網絡

運用Venny軟件對藥物化合物對應靶點1069個以及疾病靶點11673個取交集,得出交集基因150個,得到Venny圖,見圖1。將交集基因輸入string數據庫中得到蛋白相互作用網絡,見圖2。節點數為154,邊數為890,平均節點度11.6,平均局部聚類系數為0.446,PPI富集P值:<1.0e-16。運用R軟件分析得到節點度最高的基因為 Akt1,取前30位繪制柱狀圖,見圖3。

注:紫色代表藥物,黃色代表疾病,數字代表靶點個數。

圖3 節點度前30位基因柱狀圖

2.4 化合物—靶點網絡

將分析得到的藥物和疾病的共同基因導入Cytoscape_v3.7.2,構建香藿噴霧劑與新冠肺炎的“活性成分-靶點”網絡圖,見圖4。橢圓形代表活性成分,菱形代表基因靶點,活性成分中艾葉為天藍色,薄荷為深藍色,蒼術為淡青色,丁香為紫紅色,藿香為黃褐色,香薷為淡黃色,重復的活性成分為紅色,基因靶點為深紅色。運用Cytoscape_v3.7.2分析得到連接度較高的活性成分包括木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、山柰酚(kaempferol)、金合歡素(acacetin)、葛花苷(irisolidone)蘆薈大黃素(aloe-emodin)、金圣草黃素(chryseriol)。

圖4 活性成分—靶點網絡圖

2.5 功能富集分析

引用相應插件,運用R軟件按照富集的數量和顯著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05),對交集基因進行分析,共獲得166條功能,取前20項畫出柱狀圖和點狀圖,見圖5及圖6。柱狀圖中橫坐標表示富集的基因數量,縱坐標表示基因名,p.adjust(校正后P值)數值越小表示顯著性越高,其顏色越紅。點狀圖中橫坐標代表基因所占比例,縱坐標代表基因名,圓圈的大小代表富集的基因數目,p.adjust同柱狀圖。基因富集數目較多的功能為:DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、酰胺結合、絲氨酸蘇氨酸激酶活性的蛋白、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合、肽結合、蛋白絲氨酸激酶活性、細胞因子受體結合、泛素蛋白連接酶結合。

圖5 基因功能柱狀圖

圖6 基因功能點狀圖

2.6 通路富集分析

引用相應插件,運用R軟件按照富集的數量和顯著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05)進行過濾,獲得171條通路,取前20項通路繪制柱狀圖見圖7,點狀圖見圖8。柱狀圖中橫坐標表示富集的基因數目,縱坐標表示基因名,p.adjust(校正后P值)數值越小表示顯著性越高,其顏色越紅。點狀圖中橫坐標代表基因所占比例,縱坐標代表基因名,圓圈的大小代表富集的基因數目,p.adjust同柱狀圖。富集基因數目較多的通路:血脂與動脈粥樣硬化、化學致癌—受體激活、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced gly-cosylation end products, AGEs-RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K-Akt)信號通路、神經退行性變的途徑——多種疾病、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、流體剪切力與動脈粥樣硬化、化學致癌作用—活性氧物種。

2.7 分子對接結果分析

運用Autodockvina1.1.2進行分子對接,得到4種配體與10種蛋白受體的結合能。供體與受體蛋白分子對接的結合能越低,兩分子間結合的構象越穩固,發生的相互作用可能性越大。結合能小于或等于0時為受體和配體可自由結合。筆者查閱相關文獻分析后,以結合能≤-5.0 kcal/mol和結合能≤-7.5 kcal/mol為篩選條件,結合能≤-5.0 kcal/mol時結合的較好[4],結合能≤-7.5 kcal/mol結合的非常好[5]。分子對接結果,表明核心靶點與重要化合物可以很好地結合,見表2。

表2 活性成分與靶點對接分子結合能

3 討論

香藿噴霧劑借鑒了古代香薰療法,是將傳統名方與現代科技結合研制出的噴霧劑,具有芳香化濁、辟穢祛濕等功用。復方中藥多成分、多靶點、多通路的特點體現了中醫的整體觀念,網絡藥理學構建的“化合物—靶點”網絡正符合這種特點,適用于對中藥復方的預測研究,其不同于以往的單藥、單靶點研究,為中藥今后的研究提供了新思路,為中醫現代化拓寬了道路,符合中西醫結合的發展趨勢。

本研究預測了香藿噴霧劑的主要活性成分及作用靶點,并查閱相關文獻,進一步驗證了本研究的可靠性。通過靶點網絡分析其主要化合物包括木犀草素、柚皮素、漢黃芩素、山柰酚、金合歡素等,蛋白互作網絡分析其主要靶點有Akt1、 ESR1、 IL-6、MAPK3、 MAPK1等。功能分析顯示其化合物主要作用為DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、酰胺結合、絲氨酸蘇氨酸激酶活性的蛋白、泛素樣蛋白連接酶結合。其主要通路包括血脂與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路等。91條通路含有Akt1,96個靶點與其緊密相連;46條通路含有IL-6,68個靶基因與其相關聯;108條通路含有MAPK3,78個靶點與其相關;119條通路含有MAPK1,70個靶點與其相關。依據基因富集數目進行排序,前20位通路中有9條涉及病毒感染,2條涉及動脈粥樣硬化,1條涉及炎癥反應。前40位通路中,10條涉及病毒感染,4條涉及炎癥反應,2條涉及動脈粥樣硬化。據此可知信號通路主要富集于血脂與動脈粥樣硬化,病毒感染和炎癥反應等通路。分子對接結果表明核心靶點與重要化合物可以很好地結合。所以香藿噴霧劑可能通過木犀草素、柚皮素、漢黃芩素等化合物,作用于Akt1、ESR1、IL-6等靶點,調節抗病毒、抗炎癥、脂質等方面的信號通路發揮治療新冠肺炎的作用。

3.1 香藿噴霧劑重要化合物

據本研究所含化合物預測香藿噴霧劑各組分具有抗炎、抗病毒、調節免疫等藥理作用[6-12],部分化合物還有調節血脂代謝的作用[13]。木犀草素能夠抑制PI3K-Akt、絲裂原激活的蛋白激酶/激活蛋白1(mi- togen-activated protein kinase /activator protein 1, MAPK/AP-1)等通路[14]的傳導。其還能通過抑制肺部炎癥中的MAPK信號路徑來減少脂多糖引起的急性肺損傷[15]。并且其具有廣泛的抗病毒活性,木犀草素與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2, SARS-Cov-2)表面刺突蛋白特異性結合,從而抑制病毒進入宿主細胞,并且抑制病毒感染所需的嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒3-糜蛋白酶樣蛋白酶(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 3-chymotrypsin-like, SARS-Cov3cl)[16]。

3.2 核心靶點及功能分析

通過功能分析及通路分析,香藿噴霧劑治療疾病的可能靶點為Akt1。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,包括Akt1、Akt2、Akt3。Akt1也稱為蛋白激酶B,其主要功能為調節細胞存活,參與胰島素信號傳導,在血管生成和腫瘤形成方面發揮關鍵作用?；钚訟kt1具有促進病毒蛋白合成的作用[17],Akt1的顯性陰性突變體可以顯著抑制RNA病毒表達,并進一步降低病毒衣殼蛋白表達和病毒釋放[18]。運用Akt抑制劑,與SARS-CoV-2感染相關的CXCL9、CXCL10和CXCL11基因表達顯著減少[19]。

3.3 信號通路分析

Akt是PI3K途徑的下游介質,Akt的激活依賴于PI3K途徑,Akt/PI3K是許多信號通路的關鍵組成部分。PI3K/Akt信號傳導路徑可能涉及到病毒進入細胞。新冠病毒進入細胞有兩種主要受體:血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和CD147,CD147可以誘導PI3K-Akt路徑的激活。研究表明,PI3K-Akt信號通路調節相關網格蛋白從而介導SARS-CoV-2內吞作用的發生[20]。SARS-CoV-2通過上調細胞內活性氧水平來抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/ 雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/AKT/mTOR) 途徑,從而促進自噬反應。SARS-CoV-2誘導的自噬會觸發感染細胞的炎癥反應和凋亡[21]。抑制PI3K/Akt信號轉導通路可以抑制核因子-κB(nuclearfactorkappa-B, NF-κB)和AP-1,最終抑制IL-6等炎癥細胞因子和TNF-α的表達[22]。脂蛋白(a)在動脈粥樣硬化、動靜脈血栓形成中具有關鍵作用,有報道稱在新冠肺炎炎癥風暴后,IL-6可能誘導脂蛋白(a)水平的增加,說明脂蛋白(a)與炎癥通路之間存在一定聯系[23]。有研究發現新冠肺炎患者血漿中高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平降低,其降低與炎癥標志物C反應蛋白水平升高以及細胞因子風暴的產生可能具有關聯。低濃度的HDL會促進SARS-CoV-2介導的感染,但較高的HDL顆粒濃度則會抑制SARS-CoV-2感染[24]。SARS-CoV-2為RNA病毒所以不可忽略脂質在新冠肺炎中的作用。

據本研究預測香藿噴霧劑可能通過調節脂質減少新冠病毒的復制,可能通過木犀草素等化合物抑制PI3K-Akt通路表達,活性Akt1相應減少,病毒蛋白合成減少,病毒進入細胞相應減少,并減輕細胞中IL-6等細胞因子引起的炎癥反應。木犀草素、柚皮素對新冠肺炎的治療作用已有相關基礎研究證實,本課題組擬通過液相色譜-質譜分析出主要化合物,構建小鼠疾病模型,通過隨機對照實驗驗證其余化合物對新冠肺炎的治療作用。擬通過實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法等方法檢測組織中Akt1含量以及 PI3K-Akt通路的變化表達情況,為本研究作進一步的支持。

綜上所述,本研究采用網絡藥理學的技術手段和分子對接技術對香藿噴霧劑的活性成分和靶點進行了系統性研究,闡釋了其對新冠肺炎的分子作用機制,突出了中藥制劑多成分、多靶標對機體整體調控的特點,為其治療新冠肺炎提供了理論支持。本研究尚存在一定局限性,目前還迫切需要進一步廣泛的研究和臨床試驗,包括有更多患者的臨床試驗及藥理學試驗,以進一步確認這些藥物的療效及機制,以便為新冠肺炎患者提供更好的治療方案。