柴胡加龍骨牡蠣湯化裁對失眠小鼠的神經調節機制探索

王志紅 李紅培 邢佳 李宇霄 呂麗佳 王一帆 王嘉麟

良好的睡眠是身心健康和生活質量的保證。而在現代社會,睡眠不足成為了普遍現象。大量研究表明,睡眠不足會導致包括神經系統、心血管系統等各類疾病的發生[1]。失眠屬于長期睡眠不足,包括入睡困難和維持睡眠困難,因睡眠困難、睡眠時間短或睡眠質量不佳而影響白天社會功能,呈一種病理性主觀體驗,其較睡眠不足危害更大。根據流行病學調查數據顯示,我國失眠普遍患病率為15%,老年人失眠率高達50%[2-3]。隨著人們生活節奏加快,社會、工作壓力不斷增加,失眠人群愈發趨于年輕化。失眠作為常見的睡眠障礙之一,嚴重影響患者身心健康和生活質量,但只要及時適當采取干預措施,大部分患者癥狀可有所改善[4]。

臨床上通過中醫特色診療手段(如湯藥、針灸等)改善睡眠的有效案例不勝枚舉。筆者于臨床多以柴胡加龍骨牡蠣湯化裁治療失眠,大多收獲滿意療效[5]。本實驗通過觀察柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方對失眠小鼠的短期干預探討其改善睡眠的神經調節機制,擬從客觀指標上對其做出療效評價,以期為臨床推廣提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雄性小鼠40只,體質量20～22 g,采購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2016-0002。按照中華動物倫理學要求飼養和處理動物。實驗開始前,予統一飼養條件并適應環境3天。

1.2 實驗藥物

柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方:柴胡10 g、黃芩9 g、清半夏9 g、黨參10 g、酸棗仁30 g、川芎6 g、知母6 g、生龍骨15 g、生牡蠣15 g、磁石30 g、茯苓12 g、大黃3 g、生姜9 g、大棗9 g、桂枝5 g,由北京康仁堂藥業有限公司制作配方顆粒。

酒石酸唑吡坦片[賽諾菲(北京)制藥有限公司,10 mg/片,批號:5T006]。

1.3 主要試劑、儀器與設備

對氯苯丙氨酸(Selleck,500 mg/支,批號:S4586);戊巴比妥鈉(P3761 Sigma,USA,批號:P12149);鼠斷頭器(XYC北京哲成科技有限公司);小鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutanoic acid,GABA)ELISA試劑盒(AMEKO公司);Sunrise酶標儀(TECAN公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 給小鼠自然晝夜節律及光照、自由飲水、攝食,適應性飼養3天。3天后通過隨機數字表法將40只小鼠分為空白對照組、模型組、柴胡組(柴胡加龍骨牡蠣湯治療)、唑吡坦組(酒石酸唑吡坦片治療),每組10只。

1.4.2 模型建立 實驗組(包括模型組、 柴胡組、 唑吡坦組)小鼠腹腔注射對氯苯丙氨酸(300 mg/kg,10 g/0.1 mL),空白對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。每日1次,共3日。

1.4.3 給藥方法 根據人鼠給藥劑量體表面積折算公式:鼠給藥劑量=人給藥劑量×0.9×(人體重/鼠體重)×1/3,柴胡組給予柴胡加龍骨牡蠣湯化裁顆粒3 g/kg灌胃,唑吡坦組給予酒石酸唑吡坦片5 mg/kg灌胃,模型組與空白對照組分別給予生理鹽水灌胃,共給藥7天,每日1次。給藥期間,除柴胡組1只小鼠死亡外,其余小鼠全部存活。

1.5 取材與指標檢測

最后一次給藥12小時后將全部小鼠處死:2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉,鼠斷頭器迅速斷頭,冰上快速剝離完整腦組織,隨即放入培養皿(置于冰上)中,分離腦干和前腦,置于-80℃冰箱待用。檢測時,樣品室溫解凍,按照每100 mg組織加入1 mL生理鹽水的標準,進行研磨和反復凍融,待細胞膜完全破壞后,將組織勻漿于4℃ 5 000 r/min條件下離心5分鐘,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書進行操作。利用全自動酶標儀,測定各孔的OD值,并繪制標準曲線,計算對應的濃度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 造模結果

小鼠為晝伏夜出型生物,在第3日腹腔注射對氯苯丙氨酸后24小時,測量實驗組小鼠體質量較空白對照組輕4～6 g,且更易受驚嚇,并觀察到實驗組小鼠均出現不同程度晝夜節律紊亂,表現為白天興奮,說明造模成功。見表1。

表1 造模成功后各組小鼠體質量情況

2.2 各組小鼠腦干中5-HT含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中5-HT含量較空白對照組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中5-HT含量高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中5-HT含量無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦干中5-HT含量比較

2.3 各組小鼠腦干中5-HIAA含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中5-HIAA含量較對空白照組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中5-HIAA含量高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中5-HIAA含量無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦干中5-HIAA含量比較

2.4 各組小鼠腦干中GABA含量比較

造模后,模型組小鼠腦干中GABA含量較對照組顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后,唑吡坦組、柴胡組小鼠腦干中GABA含量高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05);柴胡組與唑吡坦組小鼠腦干中GABA含量無顯著性差異(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腦干中GABA含量的比較

3 討論

睡眠—覺醒是確保機體正常運作所必需的。充足的睡眠能夠保證身體充分參與體內的晝夜節律,為各項身體機能的順利發揮提供能量儲備。當今社會百態的壓力造就了失眠人群的激增和年輕化,患者常表現為不同程度的睡眠—覺醒節律紊亂。失眠可以作為單一病癥出現,也可能是其它疾病的伴隨或繼發癥狀。嚴重的失眠會影響患者認知功能和情緒狀態,繼而加重失眠,這些神經系統癥狀的惡性循環與氨基酸類神經遞質、單胺類神經遞質的分泌改變存在一定關系[6]。

5-HT能神經元可以對睡眠—覺醒進行雙相調控[7-8],它既可以通過促進下丘腦有催眠效應的肽類物質累積,同時也能夠協同去甲腎上腺素、多巴胺等其余單胺類神經遞質,共同調控大腦睡眠。腦干中縫核內存在大量5-HT能神經元,若腦干功能遭到破壞,可引發完全性失眠。5-HIAA作為5-HT的代謝產物,可間接反映5-HT的含量與功能,5-HT和5-HIAA之間呈正相關關系。單胺氧化酶(5-HT轉化成5-HIAA的限速酶)活性在24小時睡眠剝奪后顯著增高,而隨著剝奪時間的延長逐漸減少[9]。在短期睡眠剝奪后,5-HIAA的含量也會隨之下降。

實驗證明,通過藥物干預激活5-HT能系統可以促進睡眠[10]。腦干網狀結構協同氨基酸類神經遞質構成的睡眠—覺醒神經調節回路,對睡眠—覺醒的運作和維持起著至關重要的影響。GABA約占腦干網狀結構所有神經元含量的三分之一,是一種抑制性神經遞質,能夠對藍斑、中縫核以及中腦腹側被蓋區的單胺能促覺醒系統產生抑制,從而發揮促眠作用[11-12]。失眠患者普遍存在GABA含量下降[13]。

諸多證據表明,中草藥及其活性成分或可通過調控中樞單胺類神經遞質、氨基酸類神經遞質而發揮鎮靜催眠作用[14-16]。失眠屬于中醫“不寐”范疇,古名“目不瞑”“不得眠”。該病首載于《足臂十一脈灸經》,時稱“不臥”“不得臥”“不能臥”。直至《難經·四十六難》首先提出“不寐”之名:“老人臥而不寐,少壯寐而不寤者,何也?然:經言少壯者,血氣盛,肌肉滑,氣道通,營衛之行不失于常,故晝日精,夜不寤也。老人血氣衰,肌肉不滑,營衛之道澀,故晝日不能精,夜不能寐也,故知老人不能寐也”“老人之寤而不寐,少壯之寐而不寤,系乎營衛血氣之有余不足也”,并對其病因病機做了初步論述。《靈樞·大惑論》則更為詳盡地闡釋了該病的發病病機:“衛氣不得入于陰,常留于陽。留于陽則陽氣滿,陽氣滿則陽蹺盛;不得入于陰則陰氣虛,故目不瞑矣。”雖后世諸多醫家對于失眠癥的理解有了更細化的發揮和更精準的理解,但失眠的發生總歸于《內經》所說之陽不入陰、營衛失和、臟腑失衡。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自張仲景《傷寒論》第107條“傷寒八九日,下之,胸滿煩驚,小便不利,譫語,一身盡重,不可轉側者,柴胡加龍骨牡蠣湯主之”。此類病機以少陽樞機失運、三焦不暢為主的病證,當以柴胡加龍骨牡蠣湯和解少陽、通陽瀉熱、重鎮安神[17]。小柴胡湯去甘草加龍骨、牡蠣、鉛丹、大黃、桂枝、茯苓而成的柴胡加龍骨牡蠣湯方,方中柴胡、黃芩二者合用既紓解肝氣又可除濕退熱,桂枝通陽化氣,解表同時可助柴芩之效,龍骨、牡蠣共奏重鎮安神之功,合墜痰下氣者鉛丹,安神鎮驚效果更著,半夏、生姜和胃降逆順氣,使臥安眠好,茯苓利小便,大黃通腑,二便調和則納寐自佳,再添人參、大棗二味補氣養營而安神,去有甘緩留邪之嫌的甘草,遂成此集升降、補瀉、溫清并存方,可解表里錯雜之邪。

現代人或壓力過大、精神過度緊張,或暴飲暴食、飲食不合理,或久坐久臥、缺少運動,多表現為情志煩躁、脾胃失和、大便不通、失眠多夢等少陽樞機失運、三焦不暢之象,辨證為此之內傷雜病皆可用去鉛丹(鉛丹由于其毒性,以類效的磁石替代)加磁石的柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁。肝氣郁結或痰熱內擾,均可引起少陽樞機不利出現失眠,這是現代人失眠的主導因素。現代醫家也多用該方治療因氣機阻滯兼見情志不遂的失眠,皆有確切療效[18-22]。考慮到現代人多有因工作、生活學習壓力大而致飲食不合理,以致脾胃多虛的情況,筆者在運用柴胡加龍骨牡蠣湯原方基礎上,常常以黨參代人參,加大健脾力度,并稍佐酸棗仁、川芎、知母,旨在合酸棗仁湯之意兼以疏肝養血安神、清心除煩,從而增強其安神功效。

本實驗驗證,柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方確可改善小鼠的失眠現象,可能與其能夠促進小鼠腦干中5-HT、5-HIAA、GABA的分泌,從而調節睡眠—覺醒有關,其短期療效和酒石酸唑吡坦相當。故臨床可據患者四診辨證,以此方化裁應用。正常睡眠—覺醒受不同腦區多種神經遞質調控。因大腦生理結構的特殊性,關于失眠發生的神經生物學機制大部分仍局限于動物實驗研究層面。本實驗雖從神經遞質入手對柴胡加龍骨牡蠣湯化裁方調節失眠的可能機制進行了初步驗證,但仍存在一定局限性,該方的作用靶點是否與其余腦區神經遞質的含量改變存在相關性尚未可知,后續還需要深層次全面化的探索。