黃花羊耳蒜醇提物及不同極性溶劑萃取物對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

陳小兵 黃麗蕓 周沛潤 許 軍 鐘衛(wèi)津

羊耳蒜屬為蘭科多年生草本植物，全世界約有428 種，我國約有52 種，廣泛分布于我國西南部各省份和地區(qū)[1]。其中約有20 種羊耳蒜屬植物作為藥用植物，有著比較久遠(yuǎn)的民間用藥歷史記載。該植物屬歷代記載中具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛等功效，可用于治療產(chǎn)后腹痛、外傷、炎癥等[2-4]。

關(guān)于黃花羊耳蒜醇提物及不同極性溶劑萃取物對人慢性髓原白血病細(xì)胞（K562）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人肺癌細(xì)胞（A549）3 種細(xì)胞增殖的影響尚未見報(bào)道。本研究制備了黃花羊耳蒜醇提物以及3 個不同極性溶劑萃取物和水溶性部位，通過實(shí)驗(yàn)考察不同極性溶劑萃取物對體外培養(yǎng)A549、MCF-7 和K562 增殖情況的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材

黃花羊耳蒜全草于2019年8月采自贛南地區(qū)，作為標(biāo)本的全草性狀及特征依照有關(guān)文獻(xiàn)的描述，經(jīng)國家二級技師顏干明博士鑒定為黃花羊耳蒜。憑證樣品保存在贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中藥標(biāo)本室。

1.2 黃花羊耳蒜醇提取物的制備

取黃花羊耳蒜全草2 kg，用90%乙醇浸泡24 h，萃取3 次，合并3 次浸泡液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾乙醇，制備得到濃縮物并通過冷凍干燥，得黃花羊耳蒜醇提物180 g，保存于干燥器皿中。

1.3 黃花羊耳蒜不同極性溶劑萃取物及其水溶性部位的制備

稱取適量黃花羊耳蒜醇提取物，加入雙蒸水將提取物溶解，制備濃度為1 mg/ml 的液體備用。然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 種溶劑分別萃取3 次，將萃取液減壓蒸餾有機(jī)溶劑后制備得到濃縮物并通過冷凍干燥，制備得到3 個不同極性溶劑萃取物。黃花羊耳蒜的提取液經(jīng)萃取后的水層部位，通過減壓濃縮、冷凍干燥，制備得到水溶性部位。

1.4 樣品液的制備

稱取制備好的黃花羊耳蒜醇提物、水溶性部位成分，用適量Ham's F-12 營養(yǎng)混合物溶解；稱取黃花羊耳蒜3 個不同極性溶劑萃取物，用適量濃度為含0.1%二甲基亞砜的Ham's F-12 營養(yǎng)混合物溶解，制備作用于細(xì)胞的各種樣品液的最終濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/ml 5 個梯度的備用液。

1.5 細(xì)胞株

A549、MCF-7、K562 3 種腫瘤細(xì)胞購買于美國ATCC 公司。

1.6 試劑及儀器

MTT（德國默克有限公司），Ham's F-12 營養(yǎng)混合物、胎牛血清、胰蛋白酶（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

真空冷凍式燥機(jī)（上海舜制儀器制造有限公司），RV-0005 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（儀生儀世（上海）生物科技有限公司），MR-96A 酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），MI52-N 型倒置顯微鏡（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（山東博科干細(xì)胞應(yīng)用研究院有限公司）。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

A549、MCF-7、K562 腫瘤細(xì)胞在含有10%胎牛血清和10% Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)中。

1.8 抗腫瘤活性的研究

按照MTT 法[5]，取對數(shù)生長期的A549、MCF-7、K562 細(xì)胞用含Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基稀釋至105mg/ml，將A549、MCF-7、K562 細(xì)胞分別接種在96 孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 ml，24 h 后將培養(yǎng)液除掉，在每個孔中加入樣品0.1 ml，每組均設(shè)置4 個復(fù)孔。同時設(shè)置空白組（加Ham's F-12 營養(yǎng)混合物0.1 ml）以及陽性對照組，各組均設(shè)置8 個復(fù)孔。其中用于黃花羊耳蒜石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取物實(shí)驗(yàn)的空白組每孔加入含有0.5% Ham's F-12 營養(yǎng)混合物的培養(yǎng)基0.1 ml。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持環(huán)境濕潤，培養(yǎng)72 h 以后，每孔加入0.01 ml、濃度為3 mg/ml 的MTT，然后放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后吸取每孔中的溶液，將二甲基亞砜0.15 ml 加入其中，最后在水平搖床上將培養(yǎng)板緩慢振搖20 min，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，并檢測其吸光度值（A），于波長495 nm 處檢測。最后按照公式，細(xì)胞抑制率（%）=（1-樣品組的A 值/對照組的A 值）×100%[5]，計(jì)算得到細(xì)胞抑制率。同時計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果

黃花羊耳蒜醇提物的不同極性萃取部位對腫瘤細(xì)胞增殖的影響見表1。實(shí)驗(yàn)顯示，黃花羊耳蒜醇提物對A549 細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且與濃度的增加有明顯關(guān)聯(lián)，對其他兩種細(xì)胞增殖無明顯影響。黃花羊耳蒜醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位濃度高時對A549 腫瘤細(xì)胞增殖有一定抑制作用。黃花羊耳蒜醇提物的正丁醇萃取部位濃度高時對A549、K562 和MCF-7 腫瘤細(xì)胞增殖均有一定抑制作用。黃花羊耳蒜醇提物的水溶性部位對A549、K562 和MCF-7 腫瘤細(xì)胞的增殖無明顯作用。

表1 黃花羊耳蒜醇提物及不同極性溶劑萃取物對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率

3 討論

本研究對黃花羊耳蒜醇提物進(jìn)行了不同極性部位的成分富集，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 種溶劑分別萃取，得到黃花羊耳蒜醇提物的3 種不同溶劑萃取物以及水溶性部位，并進(jìn)行了體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。研究表明，黃花羊耳蒜醇提物對體外培養(yǎng)的A549、MCF-7 兩種腫瘤細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。黃花羊耳蒜石油醚萃取物，在高濃度時對A549 和MCF-7 兩種腫瘤細(xì)胞增殖也有一定抑制作用，提示黃花羊耳蒜的抗腫瘤活性成分有可能存在于該部位；黃花羊耳蒜乙酸乙酯萃取物對A549 和K562 增殖有明顯抑制作用，且與濃度有直接關(guān)系；黃花羊耳蒜正丁醇萃取物高濃度時對A549、K562和MCF-7 增殖均有一定的抑制作用，提示黃花羊耳蒜的抗腫瘤活性成分也有可能存在于該部位。