電感耦合等離子體質譜法測定板藍根中重金屬元素

彭 剛,高 明,馬恩耀,楊詩慧,張路娣,劉奇越,李嘉珉,陳偉華

(1.嶺南中藥飲片有限公司,廣東佛山 528244;2.廣州中醫藥大學中藥學院,廣東廣州 510006;3.廣東漢潮中藥科技有限公司,廣東廣州 510360;4.廣州采芝林藥業有限公司,廣東廣州 510360)

中藥承載著中醫的基本理論、安全性及有效性,其質量優劣及穩定性是影響中醫藥走出國門走向世界的重要因素,中藥安全性也是國內外共同關注的焦點問題,影響中藥安全性的外源性有害物質主要有二氧化硫、重金屬、農藥殘留、黃曲霉毒素等,這些外源性有害物質對人體健康造成較強的毒害作用或在人體某些器官中累積造成慢性中毒[1-4],從而發生疾病。植物類中藥由于自身特點,受土壤污染、化肥污染、工業污染等生長環境影響、農藥使用不規范及后期產地加工和貯藏缺乏規范,均易造成重金屬污染。

板藍根為十字花科植物菘藍(IsatisindigoticaFort.)的干燥根,其性寒、味甘,具有清熱解毒、涼血利咽的功效[5],是大宗品種常用中藥材之一,廣泛用于治療感冒、抗病毒和抗流感等方面,具有抗炎、解熱鎮痛、保肝降酶、提高免疫力等藥理作用[6]。在臨床用藥方面,板藍根主要用于治療上呼吸道感染、急性傳染性肝炎、流行性乙型腦炎、流行性結膜炎等疾病[7]。板藍根亦是連花清瘟膠囊、疏風解毒膠囊這2個中成藥中的成分之一,在新型冠狀病毒感染防治中起著很大的防疫和治療作用[8]。現代研究表明,板藍根化學成分含有苷類、木脂素類、氨基酸類、生物堿類、有機酸類、多糖類及Cu、Cd等無機元素[9]。無機元素與中藥藥效緊密相關,如Cu參與造血過程和酶的合成,從而達到補血補氣和增強免疫力功效[10-11]。同時有害重金屬元素的含量過高會使人體出現異常,引起不同系統或部位的病變,甚至導致癌癥的發生,如Hg、Pb、As可導致神經系統、消化系統、免疫系統等毒性損害[12-13]。因此,測定板藍根的無機元素含量具有重要的意義。

板藍根為根類藥材,易受到土壤中重金屬元素的污染,目前關于板藍根藥材重金屬方面相關文獻報道較少,且板藍根藥材在2020版《中國藥典》中重金屬及有害元素沒有作出規定值[14]。該研究通過對30批不同產地板藍根中藥材中重金屬含量進行檢測,探討不同產地板藍根植物藥中重金屬元素的殘留特性;建立板藍根的重金屬快速檢測方法,為板藍根重金屬的限量規定提供一定的數據和方法支持。

1 材料與方法

1.1 儀器Agilent 7800電感耦合等離子體質譜儀(美國Agilent公司);MultiwavePro 型微波消解儀[安東帕(上海)商貿有限公司];XPR303S型萬分之一天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];Comfort Ⅰ 型超純水機[賽多利斯斯泰迪生物設備(北京)有限公司];空氣置換型移液器(武漢拉普蘭德科技有限公司);超純水系統(Comfort 1,德國賽多利斯公司)。

1.2 試劑標準溶液(濃度1 000 μg/mL)均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心,Pb GSB 04-1742-2004,批號213015-2;Cd GSB 04-1721-2004,批號212005-5;As GSB 04-1714-2004,批號211040-4;Hg GSB 04-1729-2004,批號211002-6;Cu GSB 04-1725-2004,批號211050-5。硝酸(德國默克股份有限公司,65%優級純);水由Milli-Q超純水處理系統制得。

1.3 樣品采集該試驗30批板藍根樣品采自甘肅、安徽、河南、河北、山西5個省,所采集樣品經廣州中醫藥大學高明教授鑒定確認板藍根為十字花科植物菘藍(IsatisindigoticaFort.)的干燥根。采集樣品50 ℃烘干,粉碎過3號篩。樣品來源詳見表1。

1.4 試驗方法

1.4.1儀器工作條件。ICP-MS射頻功率1 550 W;采樣深度為5 mm;蠕動泵轉速0.10 r/s;噴霧室溫度為2 ℃;等離子氣流速15.0 L/min;吹掃氣體為氬氣;碰撞氣體為氦氣,氣體流速5 L/min;輔助氣(氬氣)流速1 L/min;測試前用調諧液進行調諧,掃描100次,重復次數3次。微波消解程序和條件參數詳見表2。

表2 微波消解升溫程序Table 2 Microwave digestion heating procedure

1.4.2標準品貯備溶液的制備。分別精密量取Pb、As、Cd、Hg、Cu單元素標準溶液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成分別含Pb、As、Cd、Hg、Cu為1.0、0.5、1.0、1.0、10.0 μg/mL的溶液,即得。

1.4.3標準品溶液的制備。精密量取Pb、As、Cd、Cu標準品貯備液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成含Pb、As 0、1、5、10、20 ng/mL,含Cd 0、0.5、2.5、5.0、10.0 ng/mL,含Cu 0、50、100、200、500 ng/mL的系列濃度混合溶液。另精密量取Hg標準品貯備液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成分別含Hg 0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的溶液,本液應臨用配制。

1.4.4內標溶液的制備。精密量取鍺、銦、鉍單元素標準溶液適量,用水稀釋制成各含1 μg/mL的混合溶液,即得。

1.4.5供試品與空白溶液的制備。精密稱取藥材粉末0.5 g于微波消解罐中,加入硝酸7 mL,按設定的微波消解程序進行消解,冷卻后取出,緩慢打開罐蓋排氣待消解液冷卻后,用少量水多次洗滌消解罐3次,將消解液和洗滌液合并于50 mL容量瓶中,加入200 μL金單元素標準儲備液(1 μg/mL),用水定容至刻度,搖勻備用,即得供試品溶液。除不加金單元素標準溶液外,其余同法制備空白溶液。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1線性關系考察。取“1.4.3”項下不同濃度的標準品溶液各1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進樣測定。以重金屬質量濃度為橫坐標(X)、重金屬與內標響應值的比值為縱坐標(Y)進行回歸,結果見表3,可知各重金屬元素在各自范圍內線性關系良好(R2≥0.999 6)。

2.1.2檢出限、定量限。取“1.4.3”項下標準品溶液1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進樣測定11次,記錄儀器各個重金屬元素響應值,分別以儀器響應值10、3倍標準偏差對應的質量濃度為定量限、檢出限,結果見表3。

表3 線性關系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationship,detection limit and quantitative limit

2.1.3重復性。取1號樣品粉末0.5 g,精密稱6份,按“1.4.5”方法平行制備供試品溶液,在“1.4.1”儀器工作條件下進行測定,測得各元素含量并計算RSD,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量RSD分別為2.4%、1.6%、1.7%、1.4%、2.3%,說明該方法重復性良好。

2.1.4精密度。取“1.4.3”標準品溶液1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進樣測定6次,測得各元素響應值并計算RSD,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量RSD分別為2.6%、1.4%、1.7%、1.3%、2.1%,表明儀器精密度良好。

2.1.5加樣回收率。準確稱取1號粉末0.25 g,共6份樣品,分別加入混合標準溶液適量,在“1.4.1”儀器工作條件下進行測定各元素含量,計算平均回收率,結果如表4所示。從表4可以看出,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量的平均回收率分別為99.61%、99.65%、99.58%、97.63%、99.96%,RSD分別為1.43%、2.64%、3.25%、3.83%、1.43%。

表4 5種元素的加樣回收率試驗(n=3)Table 4 Sampling recovery test for five elements

2.1.6板藍根樣品各元素含量測定。根據試驗方法,利用ICP-MS測定5個省30批板藍根樣品中Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量,結果見表5。從表5可以看出,Pb含量為0.22～1.19 mg/kg,Cd含量為0.18～31.09 mg/kg,As含量為0.12～1.89 mg/kg;Hg含量為0.00～0.14 mg/kg,Cu含量為2.36～31.06 mg/kg。5種重金屬元素含量在不同產地的板藍根中均有差異。其中,Cd元素在不同產地板藍根之間含量差異最大,含量高低極值差約為30.91 mg/kg;而不同產地板藍根中Hg含量相差最小,含量高低極值差約為0.14 mg/kg。

2.2 不同產地板藍根藥材質量綜合評價

2.2.1主成分分析。利用SPSS 25.0統計分析軟件,對5個省份30批樣品的質量進行因子水平分析。為檢驗數據是否適合進行主成分分析,該研究對主成分分析的數據進行KMO檢驗和Barlett球形檢驗,結果發現,KMO為0.625,大于0.6,且Bartlett球形檢驗顯著性P=0.000,小于0.05,說明試驗數據支持主成分分析。同時,按照特征值大于1的原則,提取2個主成分(PC1、PC2),如表6中顯示,2個主成分累計方差貢獻率達到72.577%,故提取2個公共因子可以反映原變量的72.577%的方差,表明提取的主成分可以代表大部分板藍根重金屬元素含量的信息。

運用主成分分析的方法對30批樣品中Pb(X1)、Cd(X2)、As(X3)、Hg(X4)、Cu(X5)含量經SPSS 25.0統計分析軟件標準化處理后的數據進行分析,得出各主成分得分表達式(公式1～2)及綜合主成分得分表達式(公式3),可用于揭示不同產地板藍根各重金屬元素含量與板藍根質量的關系,且從結果可知板藍根質量表現出地域差異的特性,通過主成分得分表達式(公式1～3)計算5個產地30個樣品質量的主成分得分、綜合得分及質量排名,結果如表7所示。

表6 主成分分析特征值、累計方差貢獻率Table 6 Principal component analysis eigenvalues and cumulative variance contribution rates

F1= 0.554X1+0.528X2+0.495X3+0.305X4-0.277X5

(1)

F2= -0.011X1+0.214X2-0.387X3+0.740X4+0.506X5

(2)

F= 0.510F1+0.216F2

(3)

從表7可以看出,主成分綜合得分越高,質量評價越好,在5個省份產區中,可以推斷出河北安國(19號)的板藍根藥材質量最佳,其次是安徽鳳陽(7號)、河北邢臺(16號),而甘肅隴西2批樣品(1號、2號)及河南洛陽2批樣品(10號、11號)的主成分綜合得分(F)小于1,質量較差。

表7 30批樣品板藍根藥材主成分得分(F1、F2)、綜合得分(F)及排名Table 7 Main component scores(F1,F2),comprehensive scores(F)and ranking of Radix Isatidis medicinal materials in 30 batch samples

2.2.2聚類分析。采用SPSS 25.0統計學軟件對30批不同產地的板藍根藥材中5種重金屬(Pb、Cd、As、Hg、Cu)含量進行聚類分析,以重金屬含量作為聚類變量,進行Zscore標準化后,采用組間連接方法、平方歐氏距離進行層次聚類,得到聚類樹狀譜系圖(圖1)。圖1結果顯示,當平均Euclidean距離為10時,將30批樣品共分為六大類,其中,批號9、18、17、19、16、25為第一類,批號4、13、21、22、20、3、12、30、29、26為第二類,批號27、28為第三類,批號23、24、7、8為第四類,批號2、11、1、10為第五類,批號6、15、5、14為第六類。聚類分析樹狀圖顯示,同類間的重金屬含量結果相似度較高,不同類之間差異較大。因此,可以初步判斷不同產地板藍根藥材中重金屬含量的差異。

3 結論與討論

數據分析參考2020版《中國藥典》部分植物藥規定限度標準:Pb ≤ 5 mg/kg,Cd ≤ 1 mg/kg,As ≤ 2 mg/kg,Hg ≤ 0.2 mg/kg,Cu ≤ 20 mg/kg;計算不同產地板藍根藥材中5種重金屬元素含量,結果發現,板藍根Pb含量為0.22～1.19 mg/kg;Cd含量為0.18～31.09 mg/kg,有86.67%樣品超標,可能是與當地的植物生長環境、土壤污染程度有關,且所檢測的5個省份產地板藍根樣品中Cd含量均較高,推測板藍根可能是Cd富集植物;As含量為0.12～1.89 mg/kg;Hg含量為0.00～0.14 mg/kg;Cu含量為2.36～31.06 mg/kg,有26.67%樣品Cu含量超標,主要是山西、安徽、河南、河北所采板藍根Cu超標;66.67%板藍根樣品未檢測出Hg,所采集的30批樣品中Hg、Pb和As含量均不超標。

圖1 板藍根藥材中5種重金屬系統聚類分析結果 Fig. 1 Systematic clustering analysis results of five heavy metals in Radix Isatidis medicinal materials

該試驗采用微波消解結合ICP-MS的方法同時測定不同產地板藍根藥材中重金屬Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量。該樣品前處理方法簡單,檢測方法靈敏度和準確度高、檢出限低,線性關系良好,可用于快速準確測定板藍根藥材重金屬元素含量,為板藍根重金屬元素限量范圍制定提供參考依據。對檢測結果進行聚類分析,發現不同產地板藍根樣品指標含量差異較大。主成分分析結果發現30批不同產地的板藍根樣本中重金屬元素含量均有較大差異,且Pb和Cd含量對板藍根質量有較大貢獻,依據主成分綜合得分進行評價,以河北安國(19號)的板藍根藥材質量最佳,其次是安徽鳳陽(7號)、河北邢臺(16號)種植的板藍根質量較高,可考慮在上述地區對板藍根進行規范化種植發展。