蘿卜種質資源根腫病抗性鑒定與抗性基因遺傳分析

冉劍釗，孔垂豹，雍曉平，楊 峰，陳 琳，冉 科，冉茂林，李曉梅

（1.四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所 四川德陽 618000；2.四川農業(yè)大學園藝學院 成都 611130；3.蔬菜種質與品種改良四川省重點實驗室 成都 610300）

根腫病又稱根癌病，是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron）侵染引起的一種土傳病害，是造成十字花科作物經濟損失最嚴重的病害之一，威脅和制約著十字花科蔬菜產業(yè)的發(fā)展[1]。20世紀50 年代，十字花科根腫病在我國逐漸流行，至今已蔓延至我國大部分地區(qū)，尤其以西南、東南及華中地區(qū)危害最重[2]。據(jù)統(tǒng)計，根腫病在我國常年危害面積320～400 萬hm2，產量損失20%～30%[3]。

蘿卜（Raphanus sativusL.）是我國重要的十字花科蔬菜作物之一，年平均種植面積約130 萬hm2，年產量約4.5 萬t[4]。四川省蘿卜種植面積約10 萬hm2，為四川省第三大蔬菜，其不僅作鮮菜用，也是四川泡菜加工的重要原料之一，在四川現(xiàn)代農業(yè)“10+3”產業(yè)體系的“川菜”產業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位。蘿卜為根腫菌的主要寄主之一，目前遼寧、吉林、黑龍江、河南、重慶、湖北、四川一帶均有蘿卜根腫病發(fā)生，部分嚴重地塊甚至出現(xiàn)絕收現(xiàn)象[5-10]。根腫菌休眠孢子在土壤中存活在20 年以上，一旦污染土壤，采用一般的農業(yè)防治方法效果較差，而化學方法對環(huán)境污染嚴重，因此選育抗病品種被認為是最經濟、安全且有效的防治方法[11]。

種質資源根腫病抗性鑒定與抗性基因遺傳分析是培育抗病品種的理論基礎。諸多研究表明，蘿卜抗性資源主要集中在歐洲、日本，而中國蘿卜普遍缺乏抗性基因[12-15]。Rowe[12]對68 份蘿卜資源進行抗性評價，證實日本及部分法國蘿卜品種具有較強的根腫病抗性；Yang 等[14]對349 份蘿卜資源進行抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)85.06%的中國蘿卜表現(xiàn)感病，而大部分國外材料表現(xiàn)抗病；Wang 等[15]最新研究表明，82.50%中國蘿卜和57.56%的韓國蘿卜資源表現(xiàn)出感病。有關蘿卜根腫病抗性遺傳規(guī)律與抗性基因的研究較少，大部分學者認為蘿卜根腫病抗性由一對顯性主效基因控制[15-19]，目前已定位到2 個主效基因位點Crs1[16]、RsCr6[19]，而僅有Gan 等[20]認為蘿卜根腫病抗性由隱性多基因控制，并定位到5 個抗性QTLs。

綜上，雖然有關蘿卜根腫病抗性研究已取得一定進展，然而相對于其他白菜、甘藍、油菜等十字花科作物來說還遠遠滯后[21]。同時，根腫菌存在廣泛的生理小種分化現(xiàn)象，單一的抗原容易產生抗性喪失的風險[22-24]。因此，開展更廣泛的蘿卜種質資源根腫病抗性鑒定，培育對多個生理小種具有抗性的品種具有重要意義。筆者利用田間病圃鑒定篩選抗根腫病蘿卜種質資源，然后通過室內接種法對遺傳分離群體進行抗性精準鑒定，分析抗性基因遺傳規(guī)律，為后續(xù)品種選育應用、抗性基因定位及抗性機制深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 本試驗室內接種的根腫菌均采自四川省眉山市蘿卜根腫病發(fā)病田，經根腫菌Williams 鑒定系統(tǒng)[9]鑒定為4 號生理小種，經SCD 鑒定系統(tǒng)鑒定為Pb3 生理小種（菌樣：SCMS-164）[24]。

1.1.2 供試蘿卜材料 參與抗根腫病蘿卜種質資源田間篩選鑒定的各類蘿卜品種/自交系共計54份，均由四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供，各材料詳情見表1。

表1 供試蘿卜材料詳情Table 1 Details of radish materials for the experiment

1.2 方法

1.2.1 蘿卜種質資源根腫病抗性田間鑒定 蘿卜根腫病抗性種質資源田間篩選鑒定在四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所蘿卜課題組建立的根腫病抗性鑒定圃內開展，病圃位于眉山市東坡區(qū)農光村，采用水稻與蘿卜輪作模式。水稻采收后，于2019 年9 月，稻田免耕播種蘿卜。試驗采取隨機區(qū)組設計，3 次重復，每處理種子播種量不少于100粒，播種出苗20 d 后，施用少量尿素，保持田間土壤濕度在80%～90%，60 d 后進行蘿卜根腫病抗性調查。

1.2.2 室內接種鑒定 菌液制備：采集眉山田間發(fā)病的蘿卜，選擇處于發(fā)病中期、無皸裂、無腐爛的病根，清洗干凈表面泥土，用10%次氯酸鈉滅菌5 min，沖洗干凈，晾干后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ覂冉臃N鑒定時，取適量凍存病根，于培養(yǎng)箱25 ℃活化3 d，再用組織研磨機打碎，8 層紗布過濾，用血球計數(shù)板于顯微鏡下觀察濾液休眠孢子濃度，將菌液濃度調至1×108個?mL-1備用。

試驗處理與培養(yǎng)條件：選擇飽滿一致的蘿卜種子，75%酒精滅菌90 s，無菌水沖洗3 次，置于發(fā)芽盤催芽，基質于播種前1 天澆透水，每處理播種1盤，3 次重復，播種深度2 cm 左右，每穴播種2 顆，每穴注射5 mL 菌液后覆蓋基質，穴盤放入塑料托盤內，置于光照培養(yǎng)室，于25 ℃、12 h 光照條件下培養(yǎng)，接種后3 d 內不澆水，中途施用大量溶液水溶肥2 次，55 d 后調查發(fā)病情況。

1.2.3 病情分級及抗性評價標準 病情分級參照甘彩霞等[8]分級標準，略有修改（圖1）。

圖1 根腫病田間（上）與室內（下）抗性分級標準Fig.1 Classification standard of resistance to clubroot in field（up）and indoor（down）

0 級，蘿卜根系生長正常，無腫瘤；1 級，根系的須根或側根有較少細小腫瘤，主根未發(fā)生病害；2級，根系的須根或側根有較多腫瘤，主根發(fā)病較輕，稍微腫大；3 級，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側根有很多腫瘤；4 級，根系的主根異常腫大，須根、側根有很多腫瘤，根瘤總直徑超出頸粗5 倍以上，或根部出現(xiàn)腐爛，甚至植株死亡。

病情指數(shù)（DI）＝∑（發(fā)病級代表值×各級病株數(shù)）/（調查總株數(shù)×最高發(fā)病級代表值）×100；（1）

DI=0，免疫（IR）；0＜DI≤10，抗病（R）；10＜DI≤30，耐病（T）；30＜DI≤60，感病（S）；DI＞60，高感（HS）。

發(fā)病率/%＝發(fā)病株數(shù)/觀察總株數(shù)×100。（2）

1.2.4 抗性基因遺傳分析 于2020 年4 月，利用免疫級抗性材料（白雪公主）與高感材料（重慶砂罐蘿卜）正反交獲得F1，2021 年4 月，將F1代材料自交獲得F2。2021 年7 月對親本、F1、F2代材料開展室內接種鑒定，55 d 后調查數(shù)據(jù)，然后利用Excel 對病情調查結果進行χ2檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 蘿卜種質資源根腫病抗性田間鑒定

通過田間病圃鑒定發(fā)現(xiàn)，不同蘿卜種質資源對根腫病抗性存在差異（表2）。54 份蘿卜種質資源發(fā)病率在0～100%，病情指數(shù)在0～93.73，其中共鑒定到免疫級抗性材料（IR）2 份、抗病材料（R）5 份，耐病材料（T）8 份，感病材料（S）13 份，高感材料（HS）26 份。

表2 蘿卜種質資源根腫病抗性田間鑒定結果Table 2 Identification result of resistance to clubroot of radish germplasm

從蘿卜種質資源來源分析，發(fā)現(xiàn)根腫病抗性材料主要來自國外，占總抗性材料的85.71%，其中2份免疫材料分別來自日本與韓國，4 份抗性材料來自歐洲，僅有1 份抗性材料（捷夏美45）來自國內，而86.05%的國內蘿卜表現(xiàn)感病。

從蘿卜類型分析，發(fā)現(xiàn)抗病、耐病材料以長白蘿卜（6 份）、黑蘿卜（2 份）、櫻桃蘿卜（3 份）為主，僅有1 份圓白蘿卜郫縣小黃葉與1 份紅蘿卜郫縣紅蘿卜表現(xiàn)出一定耐病性，在青蘿卜和紫蘿卜中缺乏抗性種質資源。

免疫材料白雪公主與高感材料重慶砂罐蘿卜均為高代自交系（圖2），用于后續(xù)遺傳群體構建。

圖2 白雪公主（A）與重慶砂罐蘿卜（B）根腫病田間抗性鑒定Fig.2 Resistance identification of Snow White（A）and Chongqing Shaguan radish（B）to clubroot in field

2.2 蘿卜根腫病抗性基因的遺傳分析

為保證遺傳分析的準確性，采用更穩(wěn)定的室內接種鑒定法對遺傳群體進行抗性鑒定。由圖3、表3 可知，接種55 d 后的抗病親本（R）未出現(xiàn)任何病征，而感病親本（S）發(fā)病率為100%，且發(fā)病等級均在3～4 級，抗性材料白雪公主與高感材料重慶砂罐蘿卜正反交F1均表現(xiàn)出免疫級抗性，說明抗性基因具有完全顯性質量性狀的特征。在500 株F2（R×S）群體中，385 株表現(xiàn)為抗病，115 株表現(xiàn)為感病；在1506 株F2（S×R）群體中，1116 株表現(xiàn)為抗病，390株表現(xiàn)為感病。正反交組合均符合單基因顯性遺傳3∶1 分離比（抗、感比例在p=0.05 水平時χ2≤3.84），說明白雪公主含有1 對根腫病抗性基因。

圖3 親本及F1 群體根腫病抗性表現(xiàn)Fig.3 Resistance of parents and F1 population to clubroot disease

表3 遺傳群體根腫病抗性表現(xiàn)Table 3 Resistance of genetic population to clubroot disease

3 討論與結論

中國為蘿卜起源中心之一，蘿卜種質資源豐富多樣，擁有近2000 個地方品種，蘿卜不僅可以熟食、生食、加工，還可藥用和飼用，蘿卜產業(yè)在我國國民生產生活中具有重要的地位[25]。近年來，隨著人口和物質的全球化流動、農業(yè)機械化程度的不斷提高以及農業(yè)機械跨區(qū)域作業(yè)的實施，根腫病的蔓延速度加大，嚴重威脅十字花科蔬菜產業(yè)的安全生產[26]。蘿卜被認為是十字花科作物中具有較強根腫病抗性的作物，但大部分研究結果表明蘿卜抗性資源主要集中在國外，而中國蘿卜抗源較少[13-15]，筆者的供試材料中86.05%的中國蘿卜感病，與前人研究結果相似。感病品種大多數(shù)是一些有名的地方品種，如心里美、山東濰縣青、重慶胭脂紅、成都春不老、重慶草兜等，這些地方資源符合當?shù)叵M習慣，在當?shù)靥}卜生產與加工產業(yè)中發(fā)揮著重要作用。然而，根腫病的日益危害與中國蘿卜抗性資源的缺乏，對中國蘿卜產業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來了巨大威脅。根腫菌存在廣泛的生理小種分化現(xiàn)象，且抗性基因對不同生理小種具有特異性。甘彩霞等[8]以湖北長陽山區(qū)根腫菌對100 份蘿卜種質資源進行抗性鑒定評價，發(fā)現(xiàn)春不老、重慶冰糖蘿卜2 份圓白蘿卜材料表現(xiàn)抗病，而筆者的研究中2 份材料分別為高感、感病材料，可能是根腫菌生理小種不同所致。Pang 等[24]利用新建立的根腫菌SCD 鑒定系統(tǒng)，表明來自長陽山區(qū)火燒坪的根腫菌生理小種為Pb10（HBHSP-91），來自四川眉山的根腫菌生理小種為Pb3（SCMS-164），進一步證實蘿卜不同品種對根腫菌生理小種具有專化抗性，因此篩選多抗種質資源尤為必要。筆者的研究篩選到2 份對根腫菌生理小種Pb3 免疫的蘿卜材料，其是否對國內多個根腫菌生理小種具有抗性還需要進一步鑒定。

掌握根腫病抗性遺傳規(guī)律是抗病材料創(chuàng)制的理論依據(jù)。目前，十字花科作物根腫病抗性遺傳研究主要集中在白菜（B.rapa）、甘藍型油菜（B.napus）、甘藍（B.oleracea）這三大類蕓薹屬作物中，且在以上3 種作物中抗性遺傳基礎存在差異。B.rapa根腫病抗性主要是受單個顯性主效基因控制的質量性狀，B.napus根腫病抗性是由若干個獨立的顯性基因控制的質量性狀，B.oleracea根腫病抗性主要是多基因控制的數(shù)量性狀[27]。受主效基因或獨立顯性基因控制的性狀更容易進行轉育與基因定位研究，至今在大白菜上已定位27 個抗性位點，在油菜上已定位45 個抗性位點，并通過傳統(tǒng)或分子標記輔助選育手段培育了大批優(yōu)秀的白菜、油菜根腫病抗性品種[21，26-27]。然而，有關蘿卜根腫病抗性遺傳與抗性基因的研究較少，大部分學者認為蘿卜根腫病抗性由一對顯性主效基因控制[15-19]，與筆者的研究結果一致，而Gan 等[20]認為蘿卜根腫病抗性由隱性多基因控制，可能是用于試驗的蘿卜品種與根腫病生理小種不同所致。

綜上所述，蘿卜根腫病抗性田間病圃鑒定結果表明，54 份種質資源對根腫病的抗病能力存在差異。抗性蘿卜品種主要來自國外，國內大部分品種表現(xiàn)感病。筆者通過抗性遺傳規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)免疫材料白雪公主的根腫病抗性基因受一對顯性核基因控制，這一材料的獲得將加快蘿卜根腫病抗性基因的定位、克隆及抗病新品種的培育進程。