寡糖糖脂巰基雙十六烷基醚聚乙二醇寡糖雙親性物合成方法研究

鄭海富，夏勛榮，顧佳雨，李明明，夏 炎

（1.江蘇省計(jì)量科學(xué)研究院（江蘇省能源計(jì)量數(shù)據(jù)中心）蘇州實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215121；2.江蘇省計(jì)量科學(xué)研究院（江蘇省能源計(jì)量數(shù)據(jù)中心）電離輻射與醫(yī)學(xué)工程計(jì)量研究所，南京 210023）

糖類化合物經(jīng)常以共價(jià)鍵的方式與不同種類的非糖天然產(chǎn)物綴合在一起，其中糖基部分在分子中起著生物信息儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)等作用，同時(shí)影響分子的溶解性、選擇性和生物活性[1-3]，最重要的一類就是糖和脂類相連形成的糖脂化合物。糖脂的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了自組裝單層膜（SAM）模擬細(xì)胞表面蛋白特異性識別研究。SAM 是將合適基底放入到待組裝分子的溶液或氣氛中后，分子自發(fā)地通過化學(xué)鍵牢固地吸附在固體表面而形成的一種有序組合體，廣泛應(yīng)用于巰基在硅基底的結(jié)合固定，其高穩(wěn)定性的自組裝能力和優(yōu)異的抑制非特異性識別締合性能使其在醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[4-7]。蛋白與糖的特異性識別作用在細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝和免疫應(yīng)答等許多細(xì)胞的生命過程中起到重要作用，這些特異性識別作用是通過細(xì)胞表面的糖脂、糖蛋白和多聚糖物質(zhì)與凝集素蛋白的相互作用完成。

研究表明，適宜長度寡聚乙二醇（OEG）比長鏈更能有效阻抗蛋白對表面的非特異性吸附[8-9]。用含有PEG 的分子自組裝膜來阻抗蛋白非特異性吸附，推測了PEG 阻抗蛋白吸附的機(jī)理：當(dāng)?shù)鞍捉咏黀EG 修飾的表面時(shí)，結(jié)合在PEG 鏈周圍的水分子被擠壓了出來，增加了PEG 分子鏈之間的空間排斥力，這樣有助于覆蓋有PEG 的表面阻抗蛋白的非特異性吸附[10]。現(xiàn)在一般趨于認(rèn)為，PEG 抗蛋白非特異性吸附是由于其周圍緊密結(jié)合的水層阻止蛋白質(zhì)與表面的直接接觸面[11]，具有較強(qiáng)水合能力的聚乙二醇鏈，可防止可溶的生物分子例如蛋白質(zhì)的非特異性吸附。另一方面，化學(xué)改性的聚乙二醇不可促進(jìn)仿生膜流動(dòng)。顯然，有OEG 連接的功能配體之間，不僅可以提高配體和蛋白質(zhì)之間的流動(dòng)性，增加頭基與蛋白質(zhì)的接觸面，并且能夠誘導(dǎo)頭基與蛋白質(zhì)在多個(gè)作用部位之間發(fā)生特異性識別結(jié)合。

據(jù)此，本文設(shè)計(jì)合成單巰基雙十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂，該糖脂化合物以α-甘露糖作為糖脂頭基，OEG 作為間鏈，一條飽和十六烷基醚作為疏水尾鏈、帶有巰基的另一條尾鏈最為親水親油平衡固定鏈。該糖脂化合物具有活性好，常溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，立體選擇性好，平衡固定鏈末端的巰基能夠自發(fā)結(jié)合在金等基底，可形成穩(wěn)定的SAM，在SAM 研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用場景，并具有抗非特異性吸附等諸多優(yōu)點(diǎn)[12-15]。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 單巰基雙十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器設(shè)備

核磁共振波譜儀（AV-500/300，Bruke）；TOF-MS 儀（LCTIM，Micromass）；集熱式恒溫加熱攪拌器（DF-101S，南京文爾儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R210D，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；等等。

1.2 試劑

三乙二醇、烯丙基溴、乙醚，乙酸乙酯；二氯甲烷；四氫呋喃（THF）、無水硫酸鎂等試劑為分析純，購自中國國藥集團(tuán)；三甲硅基三氟甲磺酸脂（TMSOTf）、乙醇胺、無水硫酸鈉、間氯過氧苯甲酸（MCPBA）、三氟化硼合乙醚（BF3·C2H6O）和芐基三乙基氯化銨（TEBA）等試劑為化學(xué)純，購自日本百靈威試劑有限公司；等等。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程所需超純水通過UPH-IV 超純水系統(tǒng)制備。

1.3 單巰基雙十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂合成

1.3.1 烯丙氧基三甘醇的合成（TG-Ally）

10 mL 三甘醇溶解在30 mL 干燥的THF 中，室溫下攪拌30 min 后加入3.5 g 純鈉快速攪拌1 h，滴加15 mL 烯丙基溴，繼續(xù)反應(yīng)6 h。減壓蒸餾后的殘留物用30 mL 二氯甲烷溶解，用飽和NaCl 溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾濃縮后柱層析提純得到無色油狀產(chǎn)物4 g，產(chǎn)率80%。柱層析∶硅膠：Et2O/EtOAc，1∶1。

1.3.2 烯丙氧基三甘醇酰基甘露糖合成

中間體2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亞胺酯依據(jù)本文作者為第一發(fā)明人的授權(quán)專利“一種2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亞胺酯的合成方法（ZL201510669042.9）”制備獲得。

0.5 g 2，3，4，6-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖三氯乙酰亞胺酯和1.25 g TG-Allyl 混合后溶解在10 mL 干燥的THF 中，室溫?cái)嚢?0 min，快速滴加125 μL TMSOTf，連續(xù)攪拌30 h 后，加入125 μL 乙醇胺分解多余TMSOT，用飽和NaCl 溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾濃縮柱層析得到無色黏稠狀產(chǎn)物0.4 g，產(chǎn)率為75%。柱層析∶硅膠：EtOAc/Petroleum（v/v=1∶1）。

1.3.3 氧丙基三甘醇酰基甘露糖合成

5 g 的烯丙氧基衍生物與10 g MCPBA 混合后溶于30 mL 的二氯甲烷中，緩慢加熱至50 ℃，維持該溫度攪拌反應(yīng)24 h。利用冰水混合物冷卻至0 ℃后過濾，將濃縮后的濾液與20 mL 蒸餾水混合，利用乙醚/乙酸乙酯混合溶劑（v/v=1∶2）萃取。含水相通過減壓蒸餾獲得透明固體產(chǎn)物3g，產(chǎn)率為80%。

1.3.4 單十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖合成

3 g 環(huán)氧丙基三甘醇酰基甘露糖與5 g 十六烷基醇依次溶解在20 mL 無水二氯甲烷中，60℃下攪拌2 h后，在氮?dú)夥諊戮徛渭? mL BF3·C2H6O，持續(xù)攪拌12 h，反應(yīng)物用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，有機(jī)相減壓濃縮后在真空箱內(nèi)干燥一整夜，得到無色蠟狀固體產(chǎn)物2 g。產(chǎn)率為70%。

1.3.5 三苯基硫雙十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖合成（AcM-TG-Allyl）

2 g 單十六烷基醚三甘醇酰基甘露糖固體溶解在300 mL 無水DMF 中，加入7 g 三苯基十七烷基甲磺酸鹽，室溫下攪拌20 min，加入2.6 g 氫化鈉及0.5 g 的TABI，室溫下反應(yīng)36 h。反應(yīng)物用50 mL 的二氯甲烷稀釋，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥有機(jī)相經(jīng)過過濾、濃縮后經(jīng)柱層析分離得到白色固體2.3 g，產(chǎn)率為70%。柱層析∶硅膠：EtOAc/Petroleum（v/v=2∶1），Rf=0.43。

1.3.6 三苯基硫雙十六烷基醚三甘醇四羥基甘露糖合成

2 g AcM-TG-Allyl 溶解在34 mL 無水甲醇中，加入1 g 鈉室溫?cái)嚢?0 h，加入3.3 mL 醋酸中和，濃縮后柱層析得到白色固體0.5 g，產(chǎn)率為89%。柱層析∶硅膠：CH2Cl2/MeOH（v/v=5∶1）。

1.3.7 單巰基基雙十六烷基醚三甘醇四羥基甘露糖合成

1 g 該化合物溶解在15 mL 三氯甲烷和4 mL THF的混合溶液中，通過恒壓漏斗滴加4 mL THF，室溫?cái)嚢?.5 h，加入0.1 g 的TEBA，40 ℃持續(xù)攪拌15 h。反應(yīng)液飽和NaCl 水洗滌后，有機(jī)相減壓蒸餾濃縮通過柱層析得到無色透明黏稠液體，放置冷凍室內(nèi)3 h，得到白色蠟狀固體產(chǎn)品0.6 g，產(chǎn)率為65%。柱層析∶硅膠：EtOAc/CH3OH（v/v=8∶1），Rf=0.43。

2 結(jié)論

本文針對寡糖糖脂化合物在化學(xué)法合成過程中涉及眾多羥基、醚鍵、巰基活性、催化劑選擇及極低產(chǎn)率等系列等問題，通過改善和提高兩親性含巰基寡糖糖脂的合成步驟和產(chǎn)率，創(chuàng)新了單巰基雙十六烷基醚聚乙二醇間鏈寡糖糖脂的合成方法，解決糖基供體鹵代糖的穩(wěn)定性差，不易保存、不易獲得具有潛在藥用價(jià)值糖苷化試劑的問題。合成的新型單巰基雙十六烷基醚聚乙二醇寡糖糖脂具有活性好，常溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，立體選擇性好，形成的SAM 膜穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，相應(yīng)的合成方法也可用于合成系列單雙巰基、可變烷基鏈級聚乙二醇間鏈等寡糖和多糖，在糖綴化合物合成研究領(lǐng)域有重要的作用。

致謝

本論文的前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理、調(diào)研、撰寫及后期的修改除文中所列作者的貢獻(xiàn)外，還得到了南京工大膜設(shè)計(jì)研究院有限公司楊梅高級工程師的大力協(xié)助，在此一并表示感謝。同時(shí)，該調(diào)研工作得到了江蘇省市場監(jiān)管局科研項(xiàng)目《基于腫瘤細(xì)胞表面糖簇特異性識別的蛋白納米門控釋藥競爭性靶向精準(zhǔn)治療體系構(gòu)筑及性能研究》資金支持（項(xiàng)目編號：J2022011）。