蒼夷滴鼻油對小鼠鼻黏膜損傷的修復作用及緊密連接蛋白表達的影響※

楊 鈐,楊履世,賈力莉,宋美卿,牛艷艷,白崇智,王若瑜,馮瑪莉

(1.山西省中醫院,山西 太原 030012;2.山西黃河中藥有限公司,山西 太原 030012)

鼻炎是鼻腔的慢性炎癥性疾病,主要由鼻黏膜充血、水腫等炎性損傷引發。修復對于保護鼻黏膜組織生理結構,防御病原微生物入侵,減少黏性分泌物,減輕充血、水腫、炎癥細胞浸潤等炎性反應具有重要作用。存在于上皮細胞間的緊密連接(TJs)主要作用是封閉相鄰細胞間的接縫,阻擋溶質沿細胞間隙滲入體內,構成機體與外界環境的第一道屏障,在鼻黏膜修復機制中發揮了關鍵作用。緊密連接蛋白包括跨膜蛋白Occludin、Claudins、JAMs、胞質附著蛋白ZO家族及與其相連的細胞骨架蛋白[1]。研究發現,當鼻黏膜受損時,緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin在黏膜上皮中的表達強度明顯下降,破壞上皮屏障功能[2-3]。

蒼夷滴鼻油由蒼耳子、白芷、辛夷油、冰片、薄荷油等藥物組成,具有通鼻竅、散風寒的功效。蒼夷滴鼻油具有通鼻竅和排出分泌物的作用,對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌及肺炎鏈球菌均有不同程度的抑制作用(山西黃河中藥有限公司蒼夷滴鼻油臨床應用經驗總結)。本品以蒼耳子、辛夷為君藥。蒼耳子始載于《神農本草經》,性溫,味辛、苦,歸肺經,具有散風寒、通鼻竅、祛風濕的功效。藥理學研究表明,蒼耳子具有降血糖、抗過敏、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、降血脂等作用[2]。辛夷性溫,味辛,歸脾、胃經,具有散風寒、通鼻竅等功效。藥理學研究表明,辛夷具有降壓、抗炎、抗組胺、抗過敏、鎮痛等作用[4]。

為證實蒼夷滴鼻油對鼻黏膜損傷的修復作用及其可能通過恢復黏膜上皮緊密連接蛋白表達的作用機制。本研究建立鼻黏膜損傷小鼠模型,觀察蒼夷滴鼻油對鼻黏膜紅腫程度、組織病理改變及緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達的影響。

1 材料

1.1 實驗試劑 甲醛,購自天津市申泰化學試劑有限公司,批號20171210;乙二胺四乙酸(EDTA),購自國藥集團化學試劑有限公司,批號20190315;PBS 緩沖液(即用型干粉),購自Biosharp Life Sciences,批號21183986;ZO-1免疫組化一抗(兔抗小鼠),購自北京博奧森生物技術有限公司,貨號bs-1329R,批號BA03303484;Claudin-1免疫組化一抗(兔抗小鼠),購自北京博奧森生物技術有限公司,貨號bs-1428R,批號AI10091875;Occludin免疫組化一抗(兔抗小鼠),購自北京博奧森生物技術有限公司,貨號bs-10011R,批號BA01222167;二抗(含內源性過氧化物酶封閉液、鏈霉親和素溶液)(山羊抗兔),購自北京博奧森生物技術有限公司,貨號SP-0023,批號BJ09074420;DAB顯色試劑盒(20×),購自北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號ZLI-9019,批號232010302。

1.2 實驗動物 清潔級昆明(KM)小鼠共60只,雌雄各半,體質量18~20 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司。實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0008。實驗動物質量合格證號:110322210100720285。飼養于山西省中醫藥研究院中心實驗室動物房,自由進食進水,溫度為(22±1)℃,相對濕度為40%~60%。動物倫理審查編號:SZYLY2021KY-0101。

1.3 主要儀器 全自動脫水機(Excelsior,美國Thermo公司);石蠟包埋機(TKY-BMB,湖北康泰醫療設備有限公司);旋轉石蠟切片機(F325,德國Thermo公司);萬能熒光成像系統(BX51-DP72,日本奧林巴斯)。

2 方法

2.1 分組方法 按照均衡隨機法將60只KM 小鼠分為空白對照組、模型對照組、滴通鼻炎水陽性對照組及蒼夷滴鼻油高劑量、中劑量、低劑量組,每組10只。

2.2 鼻黏膜損傷小鼠模型制備方法 參考文獻[5]的造模方法,用蒸餾水替代生理鹽水進行預實驗,根據預實驗結果確定模型制備方法:除空白對照組,其余組均以70℃蒸餾水50μL滴于小鼠雙鼻中隔黏膜,每分鐘1次,滴30次。

2.3 給藥方法 將滴通鼻炎水(廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山何濟公制藥廠,國藥準字Z44022586,規格:每瓶15 m L)與生理鹽水按照1∶4比例稀釋為滴通鼻炎水混懸液。將蒼夷滴鼻油(山西黃河中藥有限公司,國藥準字Z20053699,規格:每瓶10 m L)與溶媒(山西黃河中藥有限公司提供,為不含蒼夷滴鼻油藥味的基質)按照4∶1、2∶3、1∶4的比例分別稀釋為高、中、低濃度的蒼夷滴鼻油混懸液。空白對照組、模型對照組不做處理。滴通鼻炎水陽性對照組給予滴通鼻炎水混懸液治療,滴鼻量為5μL/(只·次·側);蒼夷滴鼻油各給藥組給予高、中、低濃度的蒼夷滴鼻油混懸液治療,滴鼻量為5μL/(只·次·側),頭部斜下方20°滴入鼻腔兩側,停留30 s。每日兩次,連續給藥7 d。

3 藥效觀察

3.1 觀察指標 ①鼻黏膜紅腫程度。給藥7 d后,取刺激區鼻中隔黏膜(帶軟骨),肉眼觀察腫脹、淤血程度并評分。0度:未見腫脹、淤血,與正常狀態比較,未發生損傷,計0分;1度:可見腫脹,未見淤血,與正常狀態比較,輕度損傷,計1分;2度:可見腫脹、淤血,與正常狀態比較,中度損傷,計2 分。②鼻黏膜病理組織學。給藥7 d后,取刺激區鼻中隔黏膜(帶軟骨)放入10%甲醛溶液固定12 h,10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣3 d后,脫水、浸蠟、包埋、切片,HE染色后光鏡下觀察各組小鼠黏膜組織結構變化,包括假復層柱狀上皮細胞、毛細血管排列整齊與否,分泌腺體是否結構清晰,毛細血管、腺體數量變化,以及黏膜與軟骨的密接程度等。③鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin免疫組化。上述病理組織石蠟切片常規脫蠟至水,微波抗原修復,高火3 次,每次5 min。內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育10 min,PBS緩沖液洗滌3次,每次3 min。封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育10 min,甩干,一抗工作液(ZO-1,1∶250;Claudin-1,1∶200;Occludin,1∶400)4 ℃過夜孵育,PBS緩沖液洗滌3次,每次3 min,二抗工作液室溫孵育10 min,PBS緩沖液洗滌3次,每次3 min。HRP標記的鏈霉親和素溶液室溫孵育10 min,緩沖液洗滌3次,每次3 min。DAB工作液顯色(顯色程度鏡下控制),蘇木素復染,脫水透明封片。染色時同批進行空白對照。每張切片隨機選取5個視野采集圖像,放大倍數為200倍。采用Image J圖像分析系統進行圖像分析。

3.2 統計學方法 采用GraphPad 8.0統計軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3.3 結果

(1)鼻黏膜紅腫程度比較 模型對照組紅腫評分高于空白對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較,滴通鼻炎水陽性對照組、蒼夷滴鼻油高劑量組紅腫評分均降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。與滴通鼻炎水陽性對照組比較,蒼夷滴鼻油高劑量組紅腫評分雖有降低,但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。圖1見本期第125頁。

表1 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜紅腫程度比較(分,±s)

表1 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜紅腫程度比較(分,±s)

注:與空白對照組比較,△P<0.05;與模型對照組比較,▲P<0.05。

組別只數紅腫評分空白對照組10 0.707±0.025模型對照組10 0.781±0.064△滴通鼻炎水陽性對照組10 0.739±0.042▲蒼夷滴鼻油高劑量組10 0.707±0.025▲蒼夷滴鼻油中劑量組10 0.731±0.041蒼夷滴鼻油低劑量組10 0.760±0.058

圖1 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜損傷紅腫程度

(2)鼻黏膜病理組織學 空白對照組:鼻黏膜表面被覆假復層柱狀上皮細胞,排列整齊,毛細血管規則,分泌腺清晰,可見杯狀細胞,胞核規則。模型對照組:鼻黏膜上皮細胞損傷,表皮細胞明顯剝脫,上皮細胞水腫,杯狀細胞肥大;基底膜層破壞,黏膜上皮層下血管明顯擴張,血管數量增多,固有層間質水腫,腺體肥大,腺管擴張,有大量炎癥細胞浸潤,整個黏膜層增厚,結構出現紊亂。滴通鼻炎水陽性對照組:表皮細胞未見明顯剝脫,上皮細胞水腫程度、杯狀細胞肥大程度減輕;黏膜上皮層下血管數量增多不明顯,固有層間質水腫好轉,肥大腺體數目較模型對照組減少,腺管擴張狀態好轉,炎癥細胞浸潤明顯減少,整個黏膜層厚度變薄,結構趨于整齊。蒼夷滴鼻油高劑量組:表皮細胞未見明顯剝脫,上皮細胞水腫程度、杯狀細胞肥大程度明顯減輕;黏膜上皮層下血管數量增多不明顯,固有層間質水腫明顯好轉,肥大腺體數目明顯減少,腺管擴張狀態好轉,炎癥細胞浸潤明顯減少,整個黏膜層厚度變薄,結構趨于整齊。蒼夷滴鼻油中劑量組:表皮細胞未見明顯剝脫,上皮細胞水腫開始減輕,杯狀細胞肥大不明顯;黏膜上皮層下血管擴張有減輕,血管數量增多不明顯,固有層間質水腫減輕,腺體體積變小,腺管擴張狀態、腺管結構好轉,固有層炎癥細胞浸潤減少,整個黏膜層增厚及結構紊亂出現好轉。蒼夷滴鼻油低劑量組:黏膜上皮細胞損傷,表皮細胞明顯剝脫,上皮細胞水腫,杯狀細胞肥大,分泌旺盛;基底膜層破壞,黏膜上皮層下血管數量增多不明顯,固有層間質水腫,腺體肥大,腺管擴張,有大量炎癥細胞浸潤,整個黏膜層增厚及結構出現紊亂程度較模型對照組略輕。圖2見本期第125頁。

圖2 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜組織病理學(×200倍)

(3)鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平比較 模型對照組ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平均低于空白對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。滴通鼻炎水陽性對照組、蒼夷滴鼻油高劑量組、蒼夷滴鼻油中劑量組ZO-1表達水平及滴通鼻炎水陽性對照組、蒼夷滴鼻油高劑量組Claudin-1、Occludin表達水平均高于模型對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。蒼夷滴鼻油高劑量組ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平與滴通鼻炎水陽性對照組比較,均無統計學差異(P>0.05);蒼夷滴鼻油高劑量組ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平與模型對照組比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。圖3見本期第125頁。

表2 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平比較(±s)

表2 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平比較(±s)

注:與空白對照組比較,△P<0.05;與模型對照組比較,▲P<0.05;與滴通鼻炎水陽性對照組比較,★P<0.05。

組別鼠數ZO-1 Claudin-1 Occludin空白對照組5 0.286±0.008 0.282±0.010 0.254±0.010模型對照組5 0.220±0.009△0.237±0.014△0.230±0.014△滴通鼻炎水陽性對照組 5 0.296±0.011▲0.297±0.044▲0.267±0.002▲蒼夷滴鼻油高劑量組5 0.290±0.020▲0.282±0.010▲0.261±0.010▲蒼夷滴鼻油中劑量組5 0.276±0.011▲★0.261±0.006★0.244±0.008★蒼夷滴鼻油低劑量組5 0.238±0.019★0.250±0.017★0.218±0.013★

圖3 6組鼻黏膜損傷小鼠鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達(×200倍)

4 討論

4.1 鼻黏膜損傷的中醫病因病機分析 導致鼻竅疾病發生的基本病因很多,外因主要為外感六淫、異物入鼻,內因主要為臟腑失調。風邪具有升發、向上、易襲陽位的特性,鼻屬陽中之陽竅,故外邪犯鼻以風邪為主。風為百病之長,寒、暑、火、熱邪常依附于風邪,而濕邪則易與他邪兼夾致病。病毒、過敏原、細菌、空氣懸浮粉塵及外界冷熱空氣變化等因素均可導致鼻病發生。除外感導致鼻病外,脾胃熱盛、肺臟虛弱、氣血失調均可導致鼻病發生。鼻為多氣多血之竅,脾統血,若脾熱移肝或胃火上攻,易致血不循經,流溢脈外而發衄血。肺主鼻,肺氣宣發,則宗氣、衛氣布散于鼻,鼻竅得以溫煦,方能溫和通利。若肺氣不足,不能宣發,易被邪毒侵襲而發鼻病。此外,氣血失調必然累及機體各項生理功能,導致疾病發生。

4.2 鼻黏膜損傷模型制備方法研究 針對鼻黏膜損傷的實驗研究發現,PM2.5刺激隨濃度升高和時間延長,鼻黏膜上皮細胞之間緊密連接完整性明顯降低[6];低氧可誘導鼻黏膜上皮細胞釋放高遷移率族蛋白B1(HMGB1),促進黏膜上皮屏障損傷[7];兔的正常鼻黏膜經過光動力療法(PDT)干預后會出現可恢復性損傷[8];大鼠鼻黏膜上皮損傷,甲硝唑、環丙沙星、慶大霉素經鼻給藥兩周,停藥后損傷黏膜迅速修復[9];通過病理形態和透射電鏡觀察,4、6、8 Gy劑量一次性照射均能很好地建立小鼠鼻黏膜急性損傷模型[10]。此外,對不同水溫刺激后大鼠鼻黏膜損傷及修復過程的組織形態學改變的研究發現,50℃、70 ℃生理鹽水滴鼻30次(每分鐘1次)刺激大鼠鼻中隔黏膜后,均可引起鼻黏膜損傷,50℃組兩周后即可修復,70 ℃組在第28日僅少數恢復,第42日后仍未完全恢復[5]。本研究參考文獻[5],用蒸餾水替代生理鹽水,通過預實驗觀察鼻黏膜損傷小鼠模型制備的可行性及損傷持續的時間,采用70 ℃蒸餾水50μL滴在小鼠雙鼻中隔黏膜,每分鐘1次,滴30次,致小鼠鼻黏膜熱損傷。

4.3 鼻黏膜上皮緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin作用分析 鼻黏膜細胞間的連接方式主要有TJs、黏附連接(AJs)、橋粒及縫隙連接4種[11]。其中,TJs是形成表皮滲透屏障和維持屏障功能的先決條件。研究發現,TJs是由多種蛋白構成的大分子復合物,呈連續的帶狀結構,圍繞著上皮或內皮細胞,在調節物質旁細胞轉運、維持細胞極性及細胞增殖、遷移、存活、分化等過程中發揮重要作用[12]。蛋白激酶C(PKC)是一類磷脂依賴性蛋白激酶,可催化多種蛋白質磷酸化,PKC介導的磷酸化和去磷酸化可調控TJs的分布和功能。作為第1種被發現的緊密連接跨膜蛋白,相鄰細胞間Occludin蛋白相互結合,參與調控旁細胞通透性及維持細胞極性。當細胞中PKC含量過高,會導致已磷酸化的Occludin蛋白去磷酸化,跨膜電阻值(TER)明顯下降,細胞極性和細胞間通透性遭到顯著破壞[13-14]。此外,Occludin蛋白過表達導致16HBE 細胞的TER 增加,FITC右旋糖苷通透性(Pa/Pc)降低,進而顯著抑制HMGB1,導致氣道上皮屏障功能損傷[15]。當敲除Occludin基因后,小鼠腸道和膀胱上皮的旁細胞通透性并未發生改變,提示Occludin可能不是構成TJ復合物所必需的結構蛋白,盡管如此,Occludin基因敲除小鼠仍然存在很多表型異常,如生長阻滯、胃黏膜上皮細胞慢性炎癥和增生、睪丸肥大、唾液腺紋狀管細胞漿內的分泌顆粒缺失等,說明在TJ的通透性調節功能方面,Occludin蛋白仍發揮著關鍵作用[16]。Claudin家族共有27個成員,分布于所有的上皮和內皮組織。其中,Claudin-1被認為是機體旁細胞屏障中較為重要的TJ蛋白,廣泛表達于各種上皮組織。敲除Claudin-1基因的小鼠因水電解質嚴重失調,僅能存活1 d[17]。目前,ZO家族中ZO-1是TJ中第1個被發現的胞漿蛋白,構成TJ網狀結構的“橋梁”分子,是參與TJ組裝與信號轉導的關鍵分子。研究發現,MDCK 單層細胞中ZO-1敲低會伴隨肌動蛋白和肌球蛋白形態學改變和重組,進而降低TER 值,增加示蹤分子透過率[18]。綜上,ZO-1、Claudin-1、Occludin對表皮、上皮和內皮等屏障功能的維持發揮關鍵作用。

滴通鼻炎水噴霧劑可祛風清熱、宣肺通竅,治療傷風鼻塞、慢性鼻炎、過敏性鼻炎、鼻竇炎等疾病臨床療效確切,因此在本研究中作為陽性對照藥。另外,根據人用劑量,將蒼夷滴鼻油用量由每日數次折算為每日1次,按照蒼夷滴鼻油∶溶媒=4∶1、2∶3、1∶4分別設置高、中、低劑量組,經滴鼻治療7 d后,蒼夷滴鼻油高劑量組鼻黏膜損傷紅腫程度明顯減輕,且可明顯上調鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達水平,保護鼻黏膜表皮完整性,減輕上皮細胞水腫和杯狀細胞肥大程度,減輕間質炎癥細胞浸潤,降低黏膜厚度,促進鼻黏膜結構恢復。本研究結果證實,蒼夷滴鼻油對鼻黏膜具有保護作用,其作用機制可能與上調鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表達有關。本研究通過制備鼻黏膜損傷小鼠模型,證明蒼夷滴鼻油對鼻黏膜損傷具有治療作用,并對其作用機制進行初步探討,但蒼夷滴鼻油對機體的調節作用仍需進一步深入研究。