產柚苷酶菌株改良、性質及其在柑橘酒中的應用研究進展

林 靜, 羅 蓮, 楊 爽, 李 萍, 張志清, 陳安均, 劉興艷

(四川農業大學食品學院,四川 雅安 611130)

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC.3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,EC.3.2.1.21)組成的復合酶[1-2]。柚苷酶是一種非常重要的工業酶,在柑橘酒的加工去苦、增強果酒香氣等方面具有重要的應用價值[3-4]。目前國內外已有許多關于柚苷酶的研究,但主要集中在菌株篩選[5-6]、發酵條件優化[7-8]及酶的分離純化[9-11]等方面,對其酶學特性和結構特性的深入研究較少。目前已有大量產柚苷酶的微生物被篩選出來,但在實際應用時,柚苷酶活力低下、生產成本高的問題仍然沒有得到解決。柚苷酶來源廣泛,不同來源的柚苷酶在酶學特性和分子結構方面存在一定的差異,對柚苷酶的酶學特性和結構特性進行分析將有助于闡明它們的催化反應和底物識別機制,挖掘其潛在應用價值。

柑橘酒是以柑橘為主要原材料,經酒精發酵、脫苦、陳釀、澄清等工藝制成的低度果酒[12]。當前中國柑橘酒工業化生產還很少見,這是因為柑橘酒加工過程中會產生強烈的苦味[13],對產品的口感造成很大的影響。研究結果表明柑橘酒的苦味主要是由柚皮苷和檸檬苦素等物質造成[14]。其中,柚皮苷不僅是典型的黃酮類苦味物質,還為柑橘酒提供了色素、風味物質、抗氧化劑,其含量高低會對酒的色澤、口感、穩定性、生物活性等產生重要的影響[15],因此,它是一種不可忽略的苦味成分。柚苷酶能有效降低柚皮苷的含量,將其轉化為無苦味的柚皮素,使柑橘酒苦味降低,保持其穩定性和感官特性。分子末端含有α-鼠李糖苷和β-葡萄糖苷的天然糖苷,均可作為柚苷酶的底物。因此,柚苷酶在食品工業中具有極其重要的作用。目前國內外都有商業化的柚苷酶上市,商業化的柚苷酶一般來源于黑曲霉和青霉菌,但由菌株發酵得到的柚苷酶分離純化困難,純化成本高,且發酵產物還含有其他水解酶,易產生副產物,這都不利于柚苷酶的純化。本文將分別對柚苷酶的來源、酶學特性、結構特性、柑橘酒中苦味物質及柚苷酶在柑橘酒中的應用進行介紹,以期為柚苷酶的高值化利用提供理論支持。

1 柚苷酶菌株篩選及菌株改良技術研究

1.1 柚苷酶

柚苷酶最早從芹菜種子中分離出來,后在柚子葉中也發現了柚苷酶,隨著研究深入,陸續從許多植物、動物和某些微生物中分離獲得了柚苷酶[16-18]。然而,由于生產成本及環境因素的限制,現在市面上的柚苷酶產品幾乎都來自于微生物,微生物來源的柚苷酶大多是胞外酶,且需要在培養基中添加誘導物如柚皮苷來誘導菌株產酶[19],誘導物價格昂貴,這在一定程度上增加了柚苷酶的生產成本。已有研究結果表明,產柚苷酶的微生物菌株主要有兩種,一種是曲霉,另一種是青霉。然而,由于黑曲霉菌的培養技術和在食品工業生產中的應用技術更加成熟,同時還由于其次生代謝產物的安全性相對較高,因此更適合食品工業生產的大規模應用。

1.2 柚苷酶菌株篩選方法

柚苷酶菌種可從自然環境中直接篩選得到。篩選產柚苷酶菌株常用到的方法有半固態試管法、定性濾紙顯色法、透明圈法等[20-21]。在菌株篩選的早期研究中,主要采用半固態試管法,菌株在試管中生長產酶,柚苷酶將柚皮苷分解形成透明層。隨著培養時間的增加,柚苷酶在培養基中擴散,透明層逐漸變大,透明層的大小可判斷菌株產酶能力的大小。該方法可初步獲得產柚苷酶能力較強的菌株。但由于柚皮苷溶解度低,會影響對透明層的觀察,從而降低實驗結果的準確性。定性濾紙顯色法是利用菌株產生的柚苷酶消耗掉柚皮苷后與柚皮苷顯色液發生顏色反應而篩選菌株的方法。該篩選方法操作簡單,但由于定性濾紙表面呈現的顏色不能作為確定該菌株產酶能力的定量依據,因此需要對產酶菌株進一步篩選。透明圈法是一種快速初步篩選菌株的方法,利用透明圈法篩選菌株時,在固體培養基中混入一些溶解性差的營養成分,使培養基渾濁、不透明。如果培養基上生長了目的菌株,就會利用這種營養成分,在菌落周圍產生透明圈。有學者發現,與半固態試管法形成的透明層相比,透明圈法形成的透明圈不僅更容易觀察,且可根據透明圈大小判斷菌株產酶能力的強弱[22],實驗操作簡單,透明圈法是目前篩選產柚苷酶菌株常用方法。

1.3 柚苷酶菌株改良技術

柚苷酶來源廣泛,但自然篩選得到的菌株產生柚苷酶活力較低,需要對菌株進行改良以提高產酶活力,目前改良產柚苷酶菌株常用到的技術有物理誘變、化學誘變[23]及基因重組技術[24]等。

1.3.1 物理誘變 物理誘變是目前常用的菌株改良技術之一,即使用紫外線、X射線、中子、微波、超聲波等誘變源對菌株進行誘變,使菌株發生突變的技術。物理誘變所用到的設備簡單、操作方便,利用誘變源進行誘變,可得到大量的高產菌株,在微生物的誘變育種中發揮了極其重要的作用[25]。袁文博等[26]利用常溫室壓等離子體技術對1株產柚苷酶菌株互隔交鏈孢霉(Alternariaalternate)SK.37001進行誘變,獲得了1株高產柚苷酶菌株(Alternariaalternate)SK.37002,產酶活力比原始菌株提高了208%。黃超等[27]從腐爛柚皮中篩選到1株黑曲霉(Aspergillusniger),并對其進行紫外誘變,選育得到了1株酶活力達933.3 U/ml的突變菌株,產酶活力是原始菌株的2.25倍。

1.3.2 化學誘變 化學誘變是指利用堿基類似物、脫氨劑、烷化劑等化學誘變劑使菌株發生突變的技術,目前常用的誘變劑有亞硝基胍(NTG)、乙烯亞胺(EI)、硫酸二乙酯(DES)、疊氮化鈉(NaN3)等。化學誘變只需少量的藥劑和簡單的設備,具有經濟方便、快速高效的優點[25]。陳玲等[28]采用NTG對出發菌株孢子進行誘變,得到1株突變菌株3-54-NTG-16,測定其酶活力達770.06 U/ml,比出發菌株提高了近100%。但在使用化學誘變劑時,一些化學誘變劑如NTG、DES等對人體健康有一定的危害,操作時應做好防護,減少與誘變劑接觸。

1.3.3 基因重組技術 基因重組技術是將生物體內控制特定性狀的基因作為外源基因,按照人為意愿定向改變生物遺傳形狀的技術,外源基因經體外重組后可轉入到受體體內并復制、轉錄、翻譯、表達,從而使受體獲得供體特定的性狀與功能[29]。利用基因重組技術,尋找合適的微生物來源的柚苷酶基因以及合適的表達載體,從而使柚苷酶高效表達,對提高柚苷酶的酶活力及其應用具有重要意義。現已有關于柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶通過酵母細胞克隆和表達的相關報道[30-32],但由于柚苷酶是一種復合酶,并不是單一的酶系,所以使得產柚苷酶微生物的基因工程育種難度較大,因此在構建產柚苷酶的基因工程菌時需對兩種酶的結構性質及相互關系進行進一步的深入研究。

1.3.4 復合誘變 復合誘變是指用兩種或兩種以上的誘變劑對生物體進行處理,從而獲得突變體的方法,包括兩種或多種誘變劑先后使用、同一種誘變劑的重復作用、兩種或多種誘變劑的同時使用。復合誘變具有協同效應,比單一誘變效果好。朱運平等[23]采用紫外線-亞硝酸鈉復合誘變,選育出1株突變菌株UN2,該菌株產柚苷酶活力達147 U/ml,且具有較好的穩定性。Xia等[33]對從發霉的柚皮中分離出的柚皮苷酶生產菌株(Aspergillustubingensis)MN589840進行紫外與常壓室溫等離子體復合誘變,篩選出1株UA13突變體,酶活力2 475.16 U/mg,產柚苷酶活力提高了206%。這些結果表明復合誘變是篩選高產柚皮苷酶菌株的有效策略。

2 柚苷酶的性質

2.1 柚苷酶的酶學性質

酶的適宜溫度范圍、pH值和熱穩定性是實現工業化生產必需考慮的因素,也是限制很多酶工業化生產的重要因素。反應體系的溫度和pH,不僅會影響底物和產物的溶解性和穩定性,而且決定著整個生產流程和對設備的要求,而酶的熱穩定性也與酶的利用率、原料損耗和生產成本等息息相關[34]。不同來源的柚苷酶,甚至相同來源不同類型的柚苷酶在酶學性質上都存在一定差異,表1總結了部分不同來源的柚苷酶及其酶學性質,從表中可以看出,不同來源柚苷酶在分子質量、最適溫度和最適pH值等方面都各不相同,但總體上其最適溫度為50～60 ℃,最適pH值為4.0～6.0。柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶的活性,在柚苷酶的作用底物上,多數柚苷酶都能夠同時水解多種糖苷鍵。α-L-鼠李糖苷酶作為柚苷酶中重要組成成分之一,可以特異性地水解聚糖或者糖苷類化合物末端的α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷鍵,釋放L-鼠李糖[35]。柑橘汁和柑橘酒中的柚皮苷能被α-L-鼠李糖苷酶水解,生成苦味稍弱的普魯寧和鼠李糖,而柚苷酶中的β-D-葡萄糖苷酶則進一步水解普魯寧,生成無苦味的柚皮素和葡萄糖。柚苷酶水解柚皮苷的流程如圖1所示,除柚皮苷外,分子末端含有α-鼠李糖苷和β-葡萄糖苷的天然糖苷,如蕓香柚皮苷、橙皮苷、蘆丁等,均可作為柚苷酶的底物[4,36]。

圖1 柚苷酶水解柚皮苷的過程

表1 不同來源的柚苷酶及其酶學性質

2.2 柚苷酶的結構特性

柚苷酶的天然來源廣泛,它們的功能相似但是結構多變。對柚苷酶的功能域分析有助于對其催化機制與底物識別的理解,關于柚苷酶的結構研究,至今尚無詳盡報道。國內外學者對柚苷酶進行研究分析發現其表現為單一的糖蛋白[37-38],這表明柚苷酶結構具有單體的特點,柚苷酶單體結構上具有兩個催化位點,一個位點用于α-L-鼠李糖苷酶的催化,另一個位點用于β-D-葡萄糖苷酶的催化[40]。目前已有研究結果表明,酪氨酸作為一種重要的殘基在α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的作用過程中參與催化[40],這似乎也證實柚苷酶是一種單體酶。但是,目前在青霉和曲霉的基因組上還沒有找到能同時編碼α-L-鼠李糖苷酶與β-D-葡萄糖苷酶基因[41-43]。相反,關于編碼這兩種酶的獨立基因卻被多次報道[44-45],同時這兩種酶也被很多學者單獨分離純化[39,46-48],這些結果暗示了柚苷酶有可能是由兩種酶組成的復合酶,而不是具有兩個酶活性位點的單鏈結合蛋白質。

雖然目前尚不知道柚苷酶的整體結構,但是許多學者對柚苷酶的兩種組成成分α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的單獨結構進行了研究,從CAZy數據庫可知,α-L-鼠李糖苷酶可來自GH78家族、GH28家族、GH106家族。隨著研究的深入,不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構已被解析(表2),Cui等[55]對來自芽孢桿菌Bacillussp.GL1菌株的柚苷酶進行結晶,確定了其α-L-鼠李糖苷酶有5個結構域,其中4個是β-三明治夾心結構,Cui指定為結構域N、D1、D2和C;另一個是(α/α)6-桶狀結構,Cui指定為結構域A,其三維結構如圖2所示,還發現α-L-鼠李糖苷酶中的(α/α)6-桶狀結構提供了一個可容納鼠李糖基的裂縫,帶負電的氨基酸殘基如Asp567、Glu572、Asp579、Glu841等在這個裂縫里可直接與鼠李糖接觸發生作用,表明這些殘基是酶催化的活性位點。Fujimoto等[56]對StreptomycesavermitilisRha(SaRha78A)及Rha與L-鼠李糖結合后的晶體結構進行了研究,發現其有6個結構域:N、D、E、F、A和C,同時發現Glu636、Glu895在酶催化過程中具有關鍵作用,這一結論也與Cui等[55]的研究結果類似。從表2也可以看出,不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構有所差異,但其結構中都含有催化結構域及β-夾層結構域。

圖2 α-L-鼠李糖苷酶的三維結構圖[55]

表2 不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的結構

有學者對β-D-葡萄糖苷酶的結構進行了研究[59-60],不同來源的β-D-葡萄糖苷酶的結構有所差異(表3),Pozzo等[61]對GH3家族的β-D-葡萄糖苷酶的結晶構造(GenBank登錄號:2X40-A)進行了報道,它由(α/β)8-結構域和三明治結構域[6條(α/β)鏈]及C端纖連蛋白Ⅲ型結構域組成。孫月龍[57]對棘孢曲霉產生的β-D-葡萄糖苷酶的三維結構(GenBank登錄號:BGL1-ASPAC)進行了模擬,其三維結構模擬圖如圖3示。該酶由1個(α/β)8-結構域和1個具有5條(α/β)鏈的三明治結構域組成,其C端沒有纖連蛋白Ⅲ型結構域,呈不規則的卷曲狀。通過比對發現該酶的活性位點是位于2個結構域表面相距較遠的Asp280與Glu509。Mohsin等[62]對β-葡萄糖苷酶的結構進行研究,結果與前面兩位學者的類似。對于柚苷酶的結構,雖然目前已有學者對其單組分的結構進行了研究,但柚苷酶的整體結構、柚苷酶兩種組成成分的比例構成,目前尚無詳盡的報道。

圖3 β-D-葡萄糖苷酶的三維結構圖[60]

表3 不同來源的β-D-葡萄糖苷酶的結構

3 柚苷酶在柑橘酒釀造中的應用

3.1 柑橘酒的脫苦

3.1.1 柑橘酒中的苦味物質 了解柑橘中的苦味物質及其降解機理,有針對性地去除其中的苦味成分對提高柑橘產品的品質至關重要。柑橘酒中的苦味主要來源于以下三個方面:(1)柑橘原料中所含的黃酮類及其衍生物質,如蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等;(2)發酵過程中無苦味物質轉變成苦味物質,也就是在榨汁和釀制時產生的“延遲苦味”,如檸檬苦素、諾米林等;(3)柑橘酒發酵過程中,由于殘糖、氨基酸和維生素等營養物質的存在,使得乳酸菌、產苦味雜菌等生長產生的苦味[14-15]。表4、表5總結了柑橘果實及柑橘酒中的主要苦味物質,從表中可以看出柑橘酒中柚皮苷的含量遠高于檸檬苦素和諾米林,是柑橘酒中主要的苦味物質。柚苷酶的作用底物柚皮苷、蕓香柚皮苷等是存在于柑橘類水果原料中的主要苦味物質,品種、采樣地點、成熟期及栽培環境不同的柑橘,其苦味成分的組成和含量也會不同。因此在柑橘酒釀造過程中,原料的選擇至關重要,柑橘類水果原料中含有大量的苦味代謝物。柑橘果肉中的柚皮苷在幼果期和果實膨脹期含量較多,到成熟階段含量則逐步下降[63],從表4可以看出柑橘果實中的苦味物質主要集中在囊衣、果皮和種子中[64],因此在進行柑橘酒釀造時,應選擇充分成熟的柑橘原料,并在榨汁時徹底去除果皮和種子,降低柑橘酒中苦味物質含量。

表4 柑橘果實中主要的苦味物質含量

表5 柑橘飲料中主要的苦味物質含量

3.1.2 柚苷酶對柑橘酒的脫苦應用研究 在柑橘汁和柑橘酒的生產中,苦味對果酒的風味及品質有一定的影響,其中以柚皮苷為主要苦味成分[72-73]。研究結果表明,在柑橘汁中,柚皮苷含量大于1.5 mg/ml會對果汁的品質產生一定的影響[74]。采用柚苷酶水解法,不僅可以有效降低柚皮苷含量,而且可以保持柑橘類產品原有的風味和營養,增加消費者的接受程度,是一項非常有前景的技術。柚苷酶水解法具有專一性強、操作簡單、不損失風味和營養等優點,是當前最理想的脫苦方式。江飛鳳等[70]采用柚苷酶對柚子酒進行脫苦,發現酶添加量2.0 g/L、反應溫度50 ℃、反應時間60 min、pH4.0時,柚子酒脫苦率為53.67%。張方艷等[75]采用柚苷酶對柑橘酒進行脫苦,發現對發酵后的柑橘酒進行加酶處理的脫苦效果比發酵前對鮮榨柑橘汁進行加酶處理的脫苦效果更好,且當柑橘酒中柚苷酶添加量為6 g/L、pH 7.0、反應溫度50 ℃、反應時間60 min時,脫苦效果最好,柑橘酒脫苦率可達到64.05%。目前國內外已有柚苷酶上市,但其在食品工業中并沒有廣泛應用,主要原因是缺乏高產柚苷酶的菌株,且柚苷酶的酶活性低,柑橘汁和柑橘酒中的低pH值環境也會抑制柚苷酶的活性。除此之外,目前對柚苷酶在柑橘酒中的脫苦研究還較少,大多集中在對柑橘汁的脫苦研究上,雖已有學者對發酵前脫苦和發酵后脫苦的柑橘酒進行研究[76],但是缺乏與原酒的對比。在用柚苷酶進行脫苦時,柚苷酶分離純化成本大,目前的試驗大多是向柑橘汁和柑橘酒中直接加入發酵粗酶液進行脫苦,這雖然能在一定程度上降低柑橘汁和柑橘酒中的苦味物質,但發酵液中的其他物質及滅酶活時的高溫環境對柑橘汁和柑橘酒的品質也存在一定的不良影響,后續可針對這些問題進行研究,提高柑橘酒的品質。

3.2 柑橘酒的增香

果酒釀造過程中的某些單萜類物質對果酒的風味有重大貢獻,這些化合物以游離形式如芳樟醇、橙花醇、香葉醇、α-松油醇、香茅醇、氧化芳樟醇或者與糖基結合的香氣前體形式存在[77]。這些香氣前體物質多為無味,以β-D-吡喃糖苷和二苷的形式存在,如6-O-α-L-呋喃糖苷-β-D-吡喃糖苷、6-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃糖苷(蘆丁苷)和6-O-β-D-吡喃糖苷-β-D-吡喃糖苷等[71],酸解或酶解時可釋放出游離態香氣物質,從而影響果酒風味。與酸解法相比,酶解法對果酒中的單萜類成分影響較小,因而更具優勢。β-D-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵配體中芳香成分和糖基間的糖苷鍵后,能有效實現增香。但當糖苷與雙糖相連時,則需要先被酶如β-木糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶或α-L-鼠李糖苷酶等水解分子末端的雙糖后,β-D-糖苷酶才能水解釋放糖苷配體[3,78],其水解釋放糖苷配體過程如圖4所示。因為香氣和苦味物質作為影響柑橘酒品質和風味的兩個重要指標,所以β-D-葡萄糖苷酶在提升柑橘酒香氣和脫苦方面的應用備受關注[3]。柚苷酶中含有β-D-葡萄糖苷酶,柚苷酶作用于柑橘酒時,不僅能脫苦,同時還能提高柑橘酒的香氣。有學者對未經脫苦處理的柚子酒和脫苦后的柚子酒香氣成分進行分析發現,脫苦處理后生成了3種新成分,分別是順-9-十六碳烯酸乙酯、正丙醇和正己酸乙酯,這3種香氣成分之間可以互相協同,提升柚子酒風味[70]。β-D-葡萄糖苷酶能有效提高柑橘酒風味,然而目前葡萄糖苷酶主要應用于葡萄酒和藍莓酒上,在柑橘酒上的研究和應用還比較少,且柑橘酒在加工過程中的很多因素都會影響β-D-葡萄糖苷酶的活性,從而影響產品風味,后續應進一步對β-D-葡萄糖苷酶在柑橘酒中的應用進行深入研究。

代表香氣物質。

4 總結及展望

綜上所述,柚苷酶是非常重要的工業酶,其在柑橘酒的脫苦及增香方面具有潛在的應用價值。近年來對柚苷酶的研究主要集中在產柚苷酶菌株的篩選,柚苷酶酶學性質及其在柑橘汁、柑橘酒脫苦應用等方面,但其結構、功能及分子生物學方面還沒有被深入研究,現有研究對柚苷酶作用的分子機制也知之甚少,其晶體結構尚未確定。除此之外,柚苷酶目前在柑橘酒中的脫苦應用研究較少,柑橘酒的脫苦效果也不理想,其產品風味受到了嚴重影響。因此,在不影響柑橘酒本身風味物質的前提下,酶解法脫苦對有效去除柑橘酒中的苦味、提高柑橘酒品質具有重要的意義。鑒于目前柚苷酶及其應用存在的問題,未來可以考慮從以下幾方面進行研究:

(1) 產柚苷酶菌一般為誘導性菌株,需要向培養基中加入誘導物誘導其產酶,誘導物價格昂貴,生產成本較高,這也是柚苷酶不能工業化生產的重要原因,后續可考慮篩選組成型的產柚苷酶菌株。

(2) 目前對柚苷酶的研究主要集中于菌種的篩選、發酵工藝優化及簡單酶學性質研究,柚苷酶是由兩種酶構成,其整體結構是單一蛋白還是組合蛋白及兩種酶的比例構成尚不清楚,如果其是單體酶,則應對其整體結構進行研究,如果是由兩種酶組成,則應對其單組分結構和組成比例進行研究。

(3) 柚苷酶分離純化成本高,且其在柑橘酒中的應用研究還較少,柑橘酒的pH值偏低,而柚苷酶的最適pH值為4～6,柑橘酒的酸性環境會抑制柚苷酶的活性。除此之外,柑橘酒中的其他成分也會抑制柚苷酶的活性,后續可考慮篩選耐酸性的高產柚苷酶的菌株,將其與酵母菌混菌發酵,在發酵的同時去除苦味物質。