玉米黃花葉病毒外殼蛋白的特征分析及亞細胞定位

王海濤, 董 巖, 任春梅, 宛柏杰, 李 碩, 程兆榜, 季英華

(1.江蘇省農業科學院植物保護研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室/國家重點實驗室培育基地,江蘇 南京 210014;2.江蘇沿海地區農業科學研究所,江蘇 鹽城 224002)

玉米是中國種植面積最大的作物,可作為糧食、飼料和工業原料,玉米病毒病害是玉米最為嚴重的病害之一,對玉米生產威脅巨大。玉米黃花葉病毒(Maize yellow mosaic virus,MaYMV)于2016年由Chen等[1]在中國首次發現并報道,隨后在亞洲其他國家、南美洲和非洲等地被相繼報道[2-9]。在中國,該病毒已擴散至云南、四川、福建、安徽和河南等地[10]。MaYMV在侵染玉米時,可引起花葉、葉片皺縮、植株矮化和紅葉等癥狀[1,11-13],除侵染玉米外,還侵染小麥、高粱、小米、甘蔗和筒軸茅等[14-18]。MaYMV主要由玉米縊管蚜(Rhopalosiphummaidis)和禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi) 以循環型、不增殖的方式傳播[12]。目前關于MaYMV蛋白功能的研究還鮮有報道。

MaYMV是Solemoviridae病毒科,馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)成員,病毒粒子為20～30 nm的二十面體結構,基因組是正義單鏈多順反子RNA,全長為5 642 個核苷酸(GenBank登錄號KU248489)。馬鈴薯卷葉病毒屬代表種馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus,PLRV)共編碼10種蛋白,分別是P0蛋白(RNA沉默抑制子)、P1蛋白、RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)、系統運動蛋白3a、外殼蛋白(Capsid protein,CP)、胞間運動蛋白(Movement protein,MP)、通讀功能域蛋白(Readthrough domain,RTD)、蛋白6、蛋白7和復制相關蛋白[19]。Chen等[1]發現MaYMV基因組編碼7個蛋白,分別是P0蛋白、P1蛋白、P2蛋白、P3(CP)蛋白、P4(MP)蛋白、P3-P5(RTD)蛋白和蛋白3a,而目前關于各蛋白的特征、定位及功能仍不明確,因此探究MaYMV蛋白的特征和定位具有重大意義。

CP是病毒含量最多的結構蛋白,在病毒粒子的組裝和分解中扮演著關鍵的作用。病毒結構的形成始于CP-CP互作以及CP-RNA的互作;除了病毒粒子的組裝外,CP通過攜帶病毒RNA在細胞間進行長距離運動[20],病毒的復制和蛋白質翻譯均受細胞內CP含量調控[21],如PLRV CP蛋白的兩個酸性功能域參與病毒粒子的組裝、系統運動和介體蚜蟲傳播[22-23]。此外,CP對于介體傳毒的特異性至關重要[23],如水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)外殼蛋白P10通過與多種介體灰飛虱因子互作,調節病毒在介體內的增殖;P10作為中間調節因子,一方面通過促進磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的磷酸化,誘導介體灰飛虱的自噬反應,促進病毒降解[24];另一方面,P10通過與磷脂酰肌醇-二磷酸的結合抑制自噬體與溶酶體的融合,抑制自噬降解,促進病毒增殖[25]。

為了解析MaYMV CP的功能,本研究以2022年8月在江蘇省內染病玉米中分離得到的MaYMV為研究對象,對其CP蛋白特征進行分析,通過構建桿狀病毒表達載體,利用草地貪夜蛾細胞對MaYMVCP基因的表達和CP蛋白定位進行分析,擬期為后續深入解析MaYMV CP與介體蚜蟲及寄主植物三者之間的互作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試病毒、細胞和試劑

供試MaYMV毒源為2022年8月采集于江蘇省的具有典型發病癥狀的玉米植株,保存于-80 ℃冰箱備用。

草地貪夜蛾細胞(Sf9)為本實驗室保存,使用Sf-900TMII SFM(10902088)培養基于28 ℃培養箱避光培養。

RNA提取試劑(R401-01)、反轉錄試劑(R312-01)和克隆載體(5 min TA/Blunt-Zero Cloning kit,C601-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;用于基因擴增的PrimeSTAR?Max DNA Polymerase(R045A)和限制性內切酶(QuickCutTMXbaI和QuickCutTMKpnI)購自TaKaRa公司;質粒提取試劑盒(TSP501-200)和感受態細胞(TreliefTM5α,TSC-C01)購自北京擎科生物科技有限公司;DH10Bac感受態細胞(10361012)和轉染試劑(LipofectamineTM3000,L300008)購自Thermo Fisher公司;pFastBac1載體由本實驗室保存;蛋白質裂解液(RIPA Lysis Buffer,P0013B)、His標簽抗體(AF2876-50)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物技術有限公司;FITC熒光Anti 6×His tag?抗體(His-FITC,ab3554)購自Abcam公司。

1.2 蛋白質特征分析

利用在線軟件(https://novopro.cn/tools/)和DNASTAR(版本號:11.1.0)對MaYMV CP氨基酸序列特征進行分析。

1.3 pFastBac1-MaYMV CP-His載體的構建

MaYMV感染的玉米總RNA提取參照RNA提取試劑盒說明書,提取的總RNA保存于-80 ℃冰箱備用?？俁NA反轉錄后利用特異性引物(pFastBac1-MaYMVCP-XbaI-F:5′-tctagaagatctATGAATACGGGAGGTAGAAATGG-3′;pFastBac1-MaYMVCP-KpnI-R:5′-ggtaccTTAATGGTGATGGTGATGATGCTATTTCGGGTTTTGAACATTG-3′。引物中小寫字母為酶切位點,下劃線部分字母為6×His標簽序列)和高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase進行擴增,根據說明書設置反應體系如下:25 μl 2×PrimeSTAR?Max DNA Polymerase Mix、5 μl cDNA模板、上下游引物各1 μl、18 μl無菌水;擴增程序如下:98 ℃ 3 min,98 ℃ 10 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,72 ℃ 8 min,16 ℃保存。獲得的片段經切膠回收后,連接至克隆載體,經PCR檢測、酶切驗證和測序驗證后,將正確的質粒連接至pFastBac1載體,利用熱激法將連接載體轉化入TreliefTM5α感受態細胞,涂布于含氨芐氯霉素的平板上,挑取單菌落,經PCR檢測后搖菌并利用試劑盒提取質粒。質粒酶切驗證和測序驗證后,將測序結果正確的質粒(pFastBac1-MaYMVCP-His)保存于-20 ℃備用。

1.4 重組穿梭質粒的制備

參照桿狀病毒表達系統說明書,制備MaYMVCP的重組穿梭質粒,方法如下:將pFastBac1-MaYMVCP-His質粒轉化至DH10Bac感受態細胞,涂布于含有100 μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、50 μg/ml卡那霉素、50 μg/ml四環素、40 μg/ml異丙基硫代半乳糖苷和7 μg/ml慶大霉素的LB平板上倒置培養,挑取白色菌落接種至含有以上抗生素的平板上復篩,將同樣為白色的菌落接種至含有50 μg/ml卡那霉素、50 μg/ml四環素和7 μg/ml慶大霉素的3 ml液體LB培養基中,在37 ℃ 220 r/min搖床上過夜振蕩培養,用于穿梭質粒的提取,將提取的質粒命名為Bacmids-MaYMVCP-His。

1.5 MaYMV CP的亞細胞定位觀察

參照LipofectamineTM3000的使用說明書,將Bacmids-MaYMVCP-His重組穿梭質粒轉染至草地貪夜蛾細胞(Sf9)中,轉染48 h后取出細胞,用1×PBS潤洗3次,使用2%的多聚甲醛固定30 min,0.1% Triton X-100滲透15 min,1×PBS潤洗3次,使用His-FITC抗體在避光條件下對細胞標記1 h,將抗體孵育處理好的細胞置于激光共聚焦顯微鏡LSM880下觀察。

1.6 MaYMV CP的Western blot分析

取重組穿梭質粒轉染后的Sf9細胞,使用蛋白質裂解液提取細胞總蛋白質,裂解后離心并吸取上清液,加入適量SDS-PAGE 5×Loading buffer,在99 ℃條件下處理10 min,12 000 r/min離心2 min。取10 μl的蛋白質樣品在12% SDS-PAGE膠上電泳,電泳結束后,使用金斯瑞eBlotTML1快速濕轉儀,參照說明書對蛋白質進行印記。使用相應的抗體對MaYMV CP-His檢測,使用天能Tanon 5200 Multi全自動化學發光成像分析系統觀察結果。

2 結果與分析

2.1 MaYMV CP特征分析

為了更加深入了解MaYMV CP的特征,我們利用DNASTAR和在線軟件從蛋白質的疏水性、信號肽、跨膜區、核定位信號和蛋白質基序(Motif)等方面對MaYMV CP蛋白特性進行了分析,結果發現MaYMV CP含有197個氨基酸,相對分子質量為2.14×104,含有36個強堿氨基酸、13個強酸氨基酸、59個疏水性氨基酸和138個親水性氨基酸,表明MaYMV CP是一個親水蛋白質。在對其信號肽和跨膜區進行分析時發現,MaYMV CP蛋白不存在信號肽和跨膜區;進一步分析發現,MaYMV CP蛋白在氨基酸序列的N端有兩個相近的核定位信號,該結果表明CP蛋白可能定位于細胞核內。在對其蛋白質motif分析時發現,MaYMV CP存在兩個酰胺化位點,表明CP蛋白可能發生酰胺化修飾。

2.2 pFastBac1-MaYMV CP-His載體的驗證

用特異性引物pFastBac1-MaYMVCP-XbaI-F和pFastBac1-MaYMVCP-KpnI-R擴增MaYMVCP,切膠回收后將其克隆至TA/Blunt-Zero中間載體,PCR檢測、酶切驗證和測序正確的質粒用于后續桿狀病毒表達載體的構建。利用T4 DNA連接酶將酶切后的片段連接至酶切后的pFastBac1載體上,得到質粒pFastBac1-MaYMVCP-His。對質粒pFastBac1-MaYMVCP-His進行菌液檢測,發現均為陽性克隆,隨后挑選2個陽性克隆,搖菌提取質粒進行酶切驗證發現兩條清晰的條帶,并且其中一條與目的片段大小一致,經測序后將陽性質粒用于重組穿梭質粒的制備。

2.3 Bacmids-MaYMV CP-His重組穿梭質粒的驗證

為了獲得重組穿梭質粒,利用熱激法將構建成功的pFastBac1-MaYMVCP-His轉化入DH10Bac感受態細胞,涂布于含有多種抗生素的LB平板上,倒置培養48 h后可以看到藍色和白色菌落,從中挑取白色菌落至新的含有多種抗生素的平板上,挑取仍為白色的菌落,接種至新鮮的含有多種抗生素的LB液體培養基中,振蕩培養16 h,提取質粒即為重組穿梭質粒Bacmids-MaYMVCP-His。

2.4 MaYMV CP的亞細胞定位和蛋白檢測

為了明確MaYMV CP的亞細胞定位,我們對轉染了Bacmids-MaYMVCP-His質粒的Sf9細胞進行熒光標記,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察,結果發現無桿狀病毒侵染的Sf9細胞內沒有His-FITC的熒光信號,僅DAPI標記的細胞核信號;而轉染了Bacmids-MaYMVCP-His質粒的細胞,可以檢測到定位于細胞質的綠色熒光信號,此外,在細胞核內也可以觀察到MaYMVCP-His的表達,這一結果表明MaYMV CP定位于細胞質和細胞核內,與預測的該蛋白質具有核定位信號的特征一致。

為了進一步明確Sf9細胞內Bacmids-MaYMVCP-His的表達,我們提取了轉染桿狀病毒質粒的細胞總蛋白質,利用Western blot進行檢測發現,轉染了桿狀病毒MaYMVCP-His的細胞內可以檢測到相對分子質量為2.2×104的目的蛋白質,而轉染了空載體的細胞內沒有檢測到目的蛋白質,但在兩種細胞內均可以檢測到單一的相對分子質量為4.4×104的內參蛋白β-actin,該結果進一步表明MaYMVCP-His在Sf9細胞內的表達。

3 討論

自2016年Chen等[1]報道MaYMV的發生與為害以來,該病毒先后在亞洲其他國家、美洲和非洲等國家和地區的玉米種植區發生和流行[2-9],該病毒對全球玉米生產造成了巨大的損失。目前,MaYMV在中國已蔓延至多個省市,給中國玉米生產造成了較為嚴重的負面影響。因此研究MaYMV蛋白質的定位,對MaYMV蛋白質的功能及其與寄主和介體的互作關系具有十分重要的意義。

病毒CP在病毒生命周期及其與寄主或者介體互作等方面發揮著十分重要的作用[26]。Dai等[27]發現,順式表達的CP蛋白對蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)在植物細胞內的運動是必需的。目前關于MaYMV CP在介體蚜蟲或者寄主植物中的功能尚不明確。

本研究對MaYMV CP氨基酸序列進行預測,結果發現,該蛋白質在N端和C端分別存在NGRR和GGRR兩個酰胺化位點。蛋白質或者多肽C端酰胺化是最重要的翻譯后修飾,對于信號轉導和受體識別等多種生物活動都至關重要,然而目前還沒有關于病毒蛋白質酰胺化調控病毒侵染的報道。MaYMV CP的C端存在的GGRR酰胺化位點是否調控該病毒在介體蚜蟲或寄主植物內的侵染,還需要進一步研究。

MaYMV主要由蚜蟲進行傳播,目前已知馬鈴薯卷葉病毒屬成員病毒以網格蛋白介導的內吞方式突破介體蚜蟲的腸道和唾液腺屏障[19]。PLRV基因組編碼的P0蛋白、P1蛋白和P7蛋白通過抑制因介體蚜蟲取食引起的寄主植物激素變化,進而促進介體蚜蟲的生殖[28],MaYMV CP是否會影響寄主植物激素變化進而影響介體昆蟲生殖反應仍需進一步研究。本研究發現,MaYMV CP含有核定位信號,并且定位于細胞質和細胞核內。有研究結果表明,水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)進入介體灰飛虱細胞核后與轉錄因子YY1互作,抑制YY1對凋亡抑制因子FAIM的激活,促進了昆蟲中腸細胞的抗病毒凋亡反應,最終抑制病毒復制[29],MaYMV CP進入細胞核后是否會調控病毒的增殖還需要進一步研究。MaYMV基因組除了編碼CP蛋白之外,還編碼P0和MP等蛋白,然而目前關于這些蛋白在植物和昆蟲細胞內的亞細胞定位及其具體功能仍不清楚,為了預防MaYMV的大面積暴發與流行,當前亟需對該病毒及其介體蚜蟲以及寄主玉米之間的互作進行深入研究。