aroC基因對遲緩愛德華氏菌生物學特性及致病性的影響

劉銳, 高大慶, 趙丹, 汪紅秋, 謝小芳, 祁琳, 易甜甜, 潘振, 張海方, 杜鴻

(1. 蘇州大學附屬第二醫院精準醫學診斷中心, 江蘇 蘇州 215004; 2. 東南大學醫學院, 江蘇 南京 210009)

遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda,Et)是腸桿菌科革蘭氏陰性短桿菌,該菌感染宿主廣泛,能夠感染魚類、兩棲類、爬行類和人類等,導致危害嚴重的魚類愛德華氏菌病,從而造成水產養殖業的巨大經濟損失;人感染此菌,會引起敗血癥、腸炎、膿胸等[1]。近年來,臨床上陸續發現患者感染Et還能引起感染性硬膜下血腫、自發性腹膜炎、急性膽管炎合并感染性休克等[2-4]。因此,研究Et的致病機制及尋找防治方法顯得極其重要。

魚類在水質差、高水溫的水環境中易被Et感染,出現眼球突出、腹部腫脹、鰭和皮膚出現點狀出血等癥狀,人類誤食感染該菌的病魚或疫水,容易引起人類愛德華氏菌病。研究發現,Et致病過程主要包括黏附和侵入宿主上皮細胞、抗宿主免疫機制、產生酶類和毒素,最后通過血液循環造成系統性感染[5]。鞭毛介導的運動性在Et致病的早期階段發揮重要作用,它使菌體穩定地附著于宿主體內并在其黏膜內大量繁殖[6]。該致病菌侵入宿主后,釋放大量過氧化氫酶、脂多糖等來抵抗宿主防御系統的殺傷作用。細菌的群體密度感應系統介導細菌種內或種間的信號交流,進而引起細菌運動性、毒性、耐藥性、生物膜形成等生理活性的改變。吲哚作為Et一種新的密度感應信號分子,不僅調控Et的運動性、生物膜形成、耐藥性、耐酸性、質粒穩定性,還參與該菌對斑馬魚的致病性[7]。

aroC基因編碼的分支酸合成酶,是芳香族氨基酸合成的關鍵酶,芳香族氨基酸對細菌在體內的生長和存活具有重要作用。該基因缺失的細菌在芳香族氨基酸缺乏的培養基中難以生長,表現出低毒力,能誘導宿主產生保護性免疫力[8]。為了確定aroC基因對Et致病性的作用,本研究通過構建EtaroC缺失株,比較該菌野生株和缺失株生物學特性的差異,為進一步探討aroC對該菌致病性的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、培養條件 本研究所用的菌株和質粒見表1。細菌用Luria-Bertani(LB)培養基培養,加入培養基抗生素終濃度分別為氯霉素(chloramphenicol,Cm)34 μg/mL,氨芐西林鈉(ampicillin sodium,Amp)100 μg/mL,鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride,Tet)50 μg/mL,多黏菌素E(colistin,Col)50 μg/mL。

表1 本研究所用的菌株和質粒

1.1.2 人喉癌上皮細胞 Hep-2細胞為南京農業大學劉錦博士惠贈。胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone公司);細胞培養液DMEM(美國Gibco公司);Solarbio鞭毛染色試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 實驗動物 28只6周齡雄性無菌級BALB/C小鼠,購買于揚州大學動物實驗中心,許可證號:SCXK(蘇)2017-0007。

1.2 方法

1.2.1aroC缺失株的構建 以ET13基因組DNA為模板,化學合成aroC基因上下游融合片段F1F2,將F1F2片段與自殺質粒pWM91進行連接,連接產物接種至LB平板(含Ampr),雙酶切鑒定重組質粒pWM91-F1F2;將該重組質粒電轉入SM10λpir中,含重組質粒的SM10λpir與ET13進行接合反應,接合產物接種至平板上(含Ampr和Colr),挑選陽性菌落,并以F1F2(表2)為引物進行PCR鑒定,篩選接合子;用含15%蔗糖的LB平板篩選aroC缺失株,挑選在Ampr和Colr雙抗平板上不生長,僅在Colr抗性平板上生長的菌落,以aroC(表2)為引物進行PCR擴增,傳代10次以后篩選穩定缺失株,所得到的缺失株命名為ΔaroC。

表2 本研究所用的引物和擴增產物大小

1.2.2aroC互補株和ΔaroC-pACYC184株的構建 以ET13基因組DNA為模板,aroC為引物(表2),PCR擴增aroC基因片段,插入到質粒pACYC184中,構建pACYC184-aroC重組質粒,將其電轉入ΔaroC中,所得到的互補株命名為CΔaroC。將空質粒pACYC184電轉入ΔaroC中,所得到的菌株命名為ΔaroC-pACYC184。

1.2.3 生長曲線測定 野生株、ΔaroC及CΔaroC株培養至對數生長期,然后調節菌液D(600 nm)=0.5,按1 ∶100比例轉接至含100 mL的LB液體培養基的三角瓶中,每小時從中取出2 mL菌液,用酶標儀測定D值,每組重復3次取平均值,根據D(600 nm)數值繪制生長曲線。

1.2.4 吲哚濃度測定 制備不同濃度吲哚標準品與其對應D(571 nm)值的標準曲線;取不同時間點野生株、ΔaroC及CΔaroC菌液,過濾取上清液,在571 nm波長下,用酶標儀測定這些上清液的D值,根據標準曲線得出相應吲哚濃度。該實驗重復3次后進行統計學分析。

1.2.5 結晶紫法檢測生物膜 分別取250 μL含菌量108CFU/mL的野生株、ΔaroC及CΔaroC加入到96孔板中,培養48 h,在570 nm波長下,用酶標儀測定每孔中菌液D值,該實驗重復3次后進行統計學分析。

1.2.6 掃描電鏡法檢測生物膜 無菌6 mm×6 mm蓋玻片置于野生株、ΔaroC及CΔaroC中,培養48 h,用電鏡觀察蓋玻片表面形成的生物膜。

1.2.7 Hep-2細胞黏附試驗 制備Hep-2細胞懸液;對數期野生株、ΔaroC菌液按感染復數(MOI)=100 ∶1分別感染Hep-2細胞,共孵育2 h后,用1%的吉姆薩染色20 min,PBS清洗3次,室溫干燥后于油鏡下觀察細菌黏附情況。加入1 mL Triton X-100裂解細胞10 min,收集裂解液,采用平板計數法計算各組細菌數。黏附率(%)=平板所得細菌數/原始加入細菌數×100%,重復3次后進行統計學分析。

1.2.8 軟瓊脂平板法檢測細菌運動性 對數期野生株、ΔaroC、S.albus接種至0.3%半固體瓊脂培養基上,CΔaroC、ΔaroC-pACYC184接種至0.3%半固體瓊脂培養基上(含Tetr),24 h后觀察各菌株鞭毛運動能力,并用游標卡尺測量運動環直徑。S.albus作為陰性對照,該實驗重復3次后進行統計學分析。

1.2.9 鍍銀法檢測細菌鞭毛形態 接種環分別沾取野生株、ΔaroC及CΔaroC至載玻片上,按試劑盒說明書進行鞭毛染色,在油鏡下觀察鞭毛形態。

1.2.10 熒光定量PCR檢測細菌fliS、flgK、fliM、flgL、fliA和fliC相對表達量 按試劑盒說明書提取細菌RNA并逆轉錄成cDNA,再以cDNA為模板,用fliS、flgK、fliM、flgL、fliA和fliC基因的引物(表2)擴增各基因,以擴增16SrRNA基因作為內標參照,定量測定各基因的轉錄水平,重復3次后進行統計學分析。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性20 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循環40次,4 ℃保存;25 μL反應體系:cDNA 7 μL,DEPC水11 μL,2× SYBR Green Mix 5 μL,上、下游引物各1 μL。

1.2.11 致病力檢測 野生株和ΔaroC株培養至對數生長期,調節菌液D(600 nm)=1.0,然后用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL,每尾斑馬魚腹腔注射10 μL該濃度菌液;空白組注射相同劑量的無菌生理鹽水,每組10尾,連續觀察1周,每天記錄斑馬魚死亡數量。以時間為橫坐標,各組斑馬魚存活率為縱坐標,繪制兩菌株感染斑馬魚的存活率圖。

1.2.12 細菌組織載量測定 野生株和ΔaroC株培養至對數生長期,調節菌液D(600 nm)=1.0,用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL;將6周齡雄性小鼠28只隨機分成野生株組和ΔaroC組(每組14只):每只小鼠腹腔注射20 μL含菌量108CFU/mL菌液(野生株或ΔaroC),在感染后1、2、3、4、5、6、7 d,每組分別取2只小鼠,斷脊處死小鼠,無菌操作,迅速解剖,取小鼠小腸、肝臟研磨均勻,研磨液稀釋一定倍數后,涂布含Colr的LB固體平板,37 ℃培養過夜;次日進行菌落計數(CFU/mL)=菌落數/平板×10×稀釋倍數。

2 結果

2.1 Et aroC缺失株和互補株的鑒定

接合子接種于LB液體培養基中培養至對數期后,涂布于15%蔗糖LB平板,取單菌落分別劃線于含Ampr+Colr雙抗的LB固體平板和含Colr單抗LB固體平板上,挑取在雙抗平板上不生長,而在單抗平板上生長的菌落,以aroC為引物做PCR鑒定,該引物擴增出來的aroC基因片段為1 200 bp。以aroC為引物擴增不出任何片段,則該菌為aroC缺失株,結果如圖1A,共獲得2株,1、3號為aroC缺失株,2號、4～7號為ET13的野生株,將aroC缺失株轉接至LB液體培養基中培養,傳代15次以后篩選穩定缺失株,于-80 ℃保種,將所得到的aroC缺失株命名為ΔaroC。將重組質粒pACYC184-aroC電擊轉化到ΔaroC株中,涂布含Tetr的LB固體平板,37 ℃培養過夜,次日從平板上挑取單菌落進行PCR鑒定,以aroC為引物能擴出aroC基因片段,說明互補株構建成功,結果如圖1B,1號為CΔaroC株,將所得到的互補株命名為CΔaroC。

A:用aroC引物進行PCR鑒定ΔaroC株;M:DL5000;1,3:ΔaroC株;2,4～7:ET13的野生株。B:PCR鑒定CΔaroC株;M:DL2000;1:CΔaroC株

2.2 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC生長能力的差異

結果如圖2所示,野生株、ΔaroC和CΔaroC株的生長速度在各個時間段無顯著差異(P>0.05),說明aroC基因缺失后,不影響ET13菌的生長能力。

圖2 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC生長能力的差異

2.3 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC胞外吲哚含量的差異

檢測野生株、ΔaroC和CΔaroC在48 h內不同時間點的胞外吲哚濃度,結果如圖3所示,上述菌株在1～7 h時胞外吲哚濃度增長較緩慢、10～13 h時增長速度較快,在13 h時吲哚濃度達到最高值,以后逐漸下降。0～1 h時,上述3種菌株的胞外吲哚濃度無顯著差異(P>0.05);在4～48 h時,ΔaroC胞外吲哚濃度明顯低于野生株(P<0.05或<0.01),CΔaroC的吲哚濃度介于野生株和缺失株之間。結果表明,4～48 h時aroC缺失后影響ET13胞外吲哚的生成。

a:P<0.05,b:P<0.01,與野生株相比

2.4 比較ET13的野生株和ΔaroC在48 h時生物膜形成的差異

細菌經過48 h的培養,在氣液交界面的孔壁上形成生物膜,人類肉眼無法觀察到,借助結晶紫染色即能直觀觀察到生物膜,又能根據染色后顏色的深淺判斷生物膜的形成量。結果見圖4A,從左到右分別為未添加菌液的LB培養基,本試驗中作為陰性對照、野生株、ΔaroC和CΔaroC株,未添加菌液的LB培養基的孔壁無色,說明無生物膜形成;野生株的孔壁呈深紫色,ΔaroC的孔壁有一點紫色,CΔaroC的孔壁顏色略淺于野生株的孔壁顏色;用酶標儀檢測每個小孔中結晶紫脫色液的D(570 nm)值,結果如圖4B所示,ΔaroC孔的D值明顯低于野生株孔(P<0.01),但高于LB孔,CΔaroC孔的D值介于野生株和缺失株之間。進一步用掃描電鏡檢測ET13菌在蓋玻片表面形成的生物膜,結果見圖4C～4E,蓋玻片表面ΔaroC細菌數及胞外多聚物量少且分布零散,野生株與CΔaroC黏附在蓋玻片表面的細菌數及胞外多聚物量多且分布密集。以上結果表明,aroC基因缺失后,ET13生物膜形成能力明顯降低。

A:結晶紫法檢測野生株、ΔaroC和CΔaroC 48 h時在96孔板中形成的生物膜,從左到右分別為未添加菌液的LB培養基(陰性對照)、野生株、ΔaroC和CΔaroC株。B:酶標儀分別檢測96孔板中LB、野生株、ΔaroC和CΔaroC的D值;a:P<0.01,與野生株相比。C～E:掃描電鏡檢測野生株、ΔaroC和CΔaroC 48 h時在蓋玻片表面形成的生物膜(×2 500)

2.5 比較ET13的野生株和ΔaroC運動能力的差異

結果如圖5A～5C所示,S.albus無鞭毛,在軟瓊脂平板上不能形成運動環。ΔaroC運動環直徑明顯小于野生株(P<0.01),該菌運動能力下降;CΔaroC運動環與野生株無明顯差異(P>0.05);ΔaroC-pACYC184與ΔaroC運動環直徑無明顯差異(P>0.05),說明pACYC184質粒不影響ΔaroC鞭毛運動。鍍銀法觀察鞭毛形態及數目,細菌菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色,結果發現ΔaroC菌體周圍只有1～2根鞭毛、較短,野生株和CΔaroC周身鞭毛密集且較長(圖5D～5F)。如圖5G所示,ΔaroC中fliC、fliA基因的轉錄水平相比野生株明顯降低(P<0.01),CΔaroC中該基因的轉錄水平處于野生株和缺失株之間,其他3個基因fliS、flgK和flgL在上述3種菌株間的轉錄水平無明顯差異(P>0.05)。上述結果表明,aroC基因缺失后,ET13鞭毛介導的運動能力下降。

A:比較野生株、ΔaroC和S.albus鞭毛運動環直徑的差異;B:比較CΔaroC和ΔaroC-pACYC184鞭毛運動環直徑的差異;C:野生株、ΔaroC、CΔaroC和ΔaroC-pACYC184的鞭毛運動環直徑統計圖;D～F:鍍銀法觀察野生株、ΔaroC和CΔaroC鞭毛形態及數目的差異(×1 000);G:qRT-PCR比較野生株、ΔaroC和CΔaroC鞭毛合成相關基因的轉錄水平;a:P<0.01,與野生株相比

2.6 比較ET13的野生株和ΔaroC黏附Hep-2細胞能力的差異

光鏡下觀察野生株和ΔaroC黏附Hep-2細胞的差異,如圖6A～6C所示,ΔaroC黏附在Hep-2細胞上的數目少于野生株。平板計數法定量檢測結果表明,ΔaroC黏附在Hep-2細胞上的黏附率明顯低于野生株(P<0.01),見圖6D。以上結果表明,aroC基因缺失后,ET13黏附上皮細胞的能力降低。姬姆薩染色后,Hep-2細胞核和細菌被染成紫藍色,細胞質被染成淺紅色。

A:未感染細菌的Hep-2細胞;B:野生株感染的Hep-2細胞;C:ΔaroC感染的Hep-2細胞;D:平板計數法定量檢測野生株和ΔaroC黏附Hep-2細胞的黏附率統計圖。a:P<0.01,與野生株相比;箭頭所示為黏附的細菌

2.7 比較ET13的野生株和ΔaroC感染斑馬魚后存活率的差異

將野生株和ΔaroC分別用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL,每尾斑馬魚腹腔注射10 μL該濃度菌液,連續觀察1周,結果如圖7所示,野生株組第1、2、3、4天各死了1尾斑馬魚,第5、6天各死了2尾,第7天存活下來2尾;缺失株組第1天無斑馬魚死亡,第2、3、4、5、6天各死了1尾,第7天存活下來5尾。感染ΔaroC株斑馬魚存活率為50%,而感染野生株斑馬魚存活率僅為20%。以上結果表明,aroC基因缺失后,ET13對斑馬魚的毒力降低,提示aroC基因與該菌對宿主的致病性相關。

圖7 比較ET13的野生株和ΔaroC感染斑馬魚后存活率的差異

2.8 比較ET13的野生株和ΔaroC在小鼠組織中存活能力的差異

野生株和ΔaroC腹腔感染小鼠1周,各菌株在小鼠腸道中的存活能力見圖8A,僅在第1天和第7天時,兩菌株在小鼠腸道中的存活數目無明顯差異(P>0.05),其他時間段ΔaroC在腸道中的存活數目低于野生株(P<0.05或<0.01)。兩菌株在小鼠肝臟中的存活能力如圖8B所示,第2天到第7天,野生株在肝臟中的存活數目高于ΔaroC(P<0.05或<0.01);但感染第1天時,兩菌株在肝臟中的存活數目無明顯差異(P>0.05)。以上結果表明,aroC基因缺失后,ET13菌在小鼠組織中存活能力降低,該基因在ET13定植過程中發揮顯著作用。

a:P<0.05,b:P<0.01,與野生株相比

3 討論

Et作為愛德華氏菌屬中唯一可以感染人的致病菌,其危害性引起臨床上極大關注。分支酸合成酶作為莽草酸代謝途徑下游支點的重要酶,影響莽草酸途徑次生代謝產物吲哚的產生;吲哚作為細菌一種新的密度感應信號分子,近幾年來受到研究者極大關注,研究發現其能參與細菌運動、黏附、抗酸性、毒力、生物膜形成等多種生理活動[9]。在Et中,吲哚可以通過CpxAR雙組分系統和Ⅲ型分泌系統參與毒力調控[10]。本研究發現,aroC基因缺失株胞外吲哚生成量明顯降低。

黏附和侵入作為Et致病過程的第一步,涉及了黏附素、鞭毛蛋白等,該菌可以黏附并侵入Hep-2細胞和HeLa細胞,鞭毛在黏附過程中可引起微絲發生重排,協助病原菌侵入到宿主體內并遷移到營養物質豐富的位置上[11]。FliA、FliC等鞭毛蛋白裝配成細菌鞭毛絲;FlgK和FlgL共同構成鞭毛鉤環狀結構,是鞭毛形成及發揮功能的重要組成部分;鞭毛蛋白FliS作為FliC的分子伴侶,與鞭毛的形成、菌株的游動性、毒性等有著密切的關系[12]。本研究結果顯示,與野生株和互補株相比,ΔaroC運動能力明顯下降、鞭毛較短且量少、fliA和fliC基因的轉錄水平降低;該缺失株黏附Hep-2細胞的能力也顯著降低。fliA和fliC基因轉錄水平降低,可能是ΔaroC運動能力降低的原因之一,具體機制有待進一步研究。細菌附著于惰性或活性實體的表面,分泌胞外多聚物將菌體包裹起來,形成的細菌聚集體膜狀物稱為生物膜。生物膜內部的細菌能逃避免疫系統的攻擊和抗菌藥物的殺傷作用,使感染易于慢性化、難于控制,從而能夠增強細菌致病性[13]。本研究應用96孔酶標板結晶紫法和掃描電鏡法檢測了野生株、ΔaroC和CΔaroC在48 h形成的生物膜,結果發現與野生株和互補株相比,ΔaroC生物膜形成能力降低。

細菌侵入宿主后分泌多種毒素,這些毒素不僅為細菌自身生長繁殖提供營養,同時也能抵抗宿主防御機制,進而有利于細菌產生致病作用。有研究發現,豬鏈球菌aroC基因缺失株表面莢膜多糖合成受阻,導致該缺失株在感染過程中與免疫細胞充分接觸,激活更高炎性反應,從而更易被宿主清除,毒力明顯降低[14]。斑馬魚存活率實驗結果顯示,感染ΔaroC斑馬魚癥狀較輕,且存活率(50%)高于野生株(20%)。進一步檢測兩菌株在小鼠腸道和肝臟中的載量,結果發現ΔaroC在小鼠腸道和肝臟中的定植能力低于野生株。

本研究結果表明,Et的aroC基因缺失株生物膜形成能力、運動性、黏附性、吲哚生成量及致病力明顯下降,為深入了解Et致病機制提供了理論基礎。然而,aroC基因是通過何種作用機制影響Et的生物學特性,需要后期進一步深入研究。