印度梨形孢（Piriformospora indica）誘導煙草對靶斑病的抗性及生理機制分析

朱 迪，李金夢，田仁進，李 震，羅富方，汪漢成，孫美麗，胡靜榮*，許本波*

1.貴州省煙草公司黔西南州公司，貴州省興義市桔山新區瑞南路60 號 562400

2.湖北文理學院現代農業研究院，湖北省襄陽市隆中路296 號 441053

3.貴州省煙草科學研究院，貴陽市觀山湖區龍灘壩路29 號 550081

4.長江大學農學院，湖北省荊州市荊秘路88 號 434025

煙草靶斑病是由立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）引起的真菌性病害。該病害在煙草苗期至成熟期均可發生，可侵染煙株葉片、莖部和葉脈等部位，影響煙葉品質，造成較大經濟損失［1-6］。據中國農藥信息網數據顯示，目前已登記防治靶斑病的單劑和混劑共14種，但已登記防治煙草靶斑病的藥劑僅有井岡霉素1種。長期使用同種藥劑可導致立枯絲核菌產生嚴重的抗藥性，增加對病害的防治難度。為解決這一難題，王潮鐘等［7］篩選出可供選擇的化學藥劑（30%苯甲·丙環唑和20%噻氟酰胺）；徐傳濤等［8］篩選出生物制劑（10 億CFU/g 海洋芽孢桿菌可濕性粉劑和3%多抗霉素水劑）等。同時，也有學者提出了土壤改良、田園清理、肥料平衡和生態調控等農業措施［9-10］，然而針對各產區復雜的氣候條件和栽種模式，煙草靶斑病的傳播速度和危害面積越來越大。因此，研發新型煙草靶斑病的綠色防控技術顯得尤為重要。

印度梨形孢（Piriformosporaindica）是一種能夠提高植物抗性的內生真菌，主要定殖于植物根部，促進植物對土壤中營養元素的吸收，從而增強植物對病害的抗性［11-12］。研究表明，印度梨形孢可誘導大麥對白粉病病原菌Blumeriagraminis、小白菜對黑斑病病原菌Alternariabrassica、玉米對輪枝鐮孢菌Fusariumverticillioides、煙草對黑脛病病原菌Phytophthoraparasitica、煙草對青枯病病原菌Ralstoniasolanacearum等產生抗病性［13-16］，其抗病性機理與植物體內保護酶活性及復雜的新陳代謝顯著相關［17］。例如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Perosidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）等均是植物體內重要的防御酶，能抵抗活性氧和氧自由基對其細胞膜系統的傷害，增強植物的抗逆性或抗病性［18］。植物器官衰老或病變通常導致膜脂過氧化反應，而丙二醛（MDA）是膜脂過氧化反應的最終產物，其含量與植物抗病性成負相關［19］。脯氨酸（Pro）是植物體中重要的蛋白質組分，在調節細胞滲透、穩定生物大分子等方面起著重要作用，在某種程度上也反映了植物的抗逆性［20］。但目前有關印度梨形孢誘導煙草對靶斑病的抗病性研究則鮮見報道。因此，采用平板對峙法、混菌法和盆栽接菌法研究印度梨形孢誘導煙草對靶斑病的抗性生理機制，并檢測了煙葉中SOD、POD、CAT、PAL、MDA 和Pro 等與抗性相關的生理指標，同時調查了印度梨形孢對煙草生長的影響，旨在為煙草靶斑病生防菌劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株培養

印度梨形孢（Pi）由長江大學生命科學學院實驗室提供；煙草靶斑病病原菌立枯絲核菌（Rs）和煙草種子（紅花大金元）由貴州省煙草科學研究院提供。參考陳佑源等［21］的方法進行印度梨形孢PDA固體培養。用無菌打孔器（ ＝5 mm）從PDA固體平板培養基上取培養7 d的菌塊，接種于PD液體培養基中，置于28 ℃，150 r/min的搖床上振蕩培養8 d，制備得到印度梨形孢菌液。將立枯絲核菌轉接至PDA固體培養基中，置于28 ℃恒溫培養箱內黑暗條件下培養3 d，備用。

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢和立枯絲核菌的生長動態測定

分別用無菌打孔器（ ＝5 mm）從PDA固體培養基上取生長良好的印度梨形孢和立枯絲核菌菌塊1塊，接種至另一裝有PDA 培養基的培養皿（ ＝15 cm）的中心位置，置于恒溫培養箱中于28 ℃黑暗條件下培養，每天測量菌落的直徑，直到菌落將培養皿布滿為止。每處理重復3次。

1.2.2 印度梨形孢和立枯絲核菌的平板對峙培養

參考1.2.1節印度梨形孢和立枯絲核菌的生長動態。先用無菌打孔器（ ＝5 mm）從PDA固體培養基上取生長良好的印度梨形孢菌塊1個，接種至另一裝有PDA 固體培養基的培養皿（ ＝9 cm）中。接種時，印度梨形孢菌塊接種至距離培養皿中心位置2 cm的左側，置于恒溫培養箱中于28 ℃黑暗條件下培養5 d，再取出該培養皿，在距離培養皿中心2 cm的右側接種立枯絲核菌菌塊（ ＝5 mm）1 塊。然后再將接種好的培養皿置于上述培養箱中繼續培養。此時開始計時，分別比較同一培養皿中立枯絲核菌培養第1天與印度梨形孢培養第6天、立枯絲核菌培養第2天與印度梨形孢培養第7天、立枯絲核菌培養第3天與印度梨形孢培養第8天菌落的長勢，測量菌落直徑大小并拍照。每處理重復3次。

1.2.3 混菌法培養印度梨形孢后接種立枯絲核菌對其生長的影響測定

參考1.2.1節印度梨形孢和立枯絲核菌的生長動態，參考胡靜榮［22］的方法進行印度梨形孢孢子懸液的制備。處理：將100 mL PDA 固體培養基融化，待溫度降至55 ℃左右時，再加入5 mL印度梨形孢孢子懸液，混勻后倒平板，將平板置于恒溫培養箱28 ℃黑暗條件下培養5 d后，再在平板中心接種生長良好的立枯絲核菌塊（ ＝5 mm）；對照：在PDA固體培養基平板中心接種同樣大小的立枯絲核菌塊。每天觀察菌落的生長情況，持續7 d，測量其直徑大小并拍照。每處理重復3次。

1.2.4 印度梨形孢在煙草根部的定殖檢測

將煙草種子用75%乙醇消毒60 s，用無菌水清洗3次，加入2.5%次氯酸鈉消毒8 min，再用無菌水洗3次。然后播種于裝有無菌基質［m（營養土）∶m（蛭石）∶m（珍珠巖）＝4 ∶2 ∶1］的培養缽中（缽口 ＝9 cm），置于溫度為26 ℃，相對濕度為75%，光周期L∶R＝14 h ∶10 h 的恒溫培養箱中培養。30 d 后挑選長勢一致的煙苗，分別向缽中澆灌100 mL印度梨形孢菌液，待第5、10、15和20 天取煙苗根系1 cm，置于10%KOH溶液中浸泡10 h，用無菌水洗滌3次后，放入1%HCl 溶液中浸泡5 min，用0.05%臺盼藍染色5 min，再用無菌水洗滌5次，然后在顯微鏡（Y-TV55，日本尼康儀器上海有限公司）400倍下檢測印度梨形孢在煙草根系的定殖情況并拍照。

1.2.5 印度梨形孢對立枯絲核菌侵染煙苗的影響測定

按1.2.4節的方法選取播種30 d后長勢一致的煙苗進行試驗。對照1（CK1）：澆灌100 mL無菌水，然后用滅菌的接種針對健康煙葉扎孔，但不接種立枯絲核菌；處理1（Pi）：澆灌100 mL 印度梨形孢菌液，然后用滅菌的接種針對健康煙葉扎孔但不接種立枯絲核菌；處理2（20Pi+Rs）：澆灌100 mL 印度梨形孢菌液，20 d后采用針刺法對健康煙葉進行處理，在傷口處放置5 mm 的待測立枯絲核菌菌餅，保濕培養；處理3（Pi+Rs）：澆灌100 mL 印度梨形孢菌液，采用上述針刺法接種立枯絲核菌；處理4（Rs）：澆灌100 mL 無菌水，采用上述針刺法接種立枯絲核菌。處理2接種Pi后20 d再接種Rs，其中接種Rs的時間與CK1、處理1、處理3、處理4在同一天進行。5次重復，每重復3株煙苗，選取每株煙的最大葉片以主脈為對稱進行接種，接種后分別在第3、6 和9 天調查煙草靶斑病的發病情況［23］，以葉片上病斑為準，測量每片煙葉上病斑直徑并取平均值。

1.2.6 生理指標測定

選1.2.5節中CK1、處理2和處理4第9天的煙葉進行生理指標測定。參考陳建勛等［24］的方法測定葉片樣品中丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量（質量分數），以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性。參考王學奎［25］的方法測定樣品中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。每處理重復5次。

1.2.7 煙草生長和光合作用測定

按1.2.4節的方法選取播種30 d后長勢一致的煙苗進行試驗。CK1：澆100 mL無菌水；處理1（Pi）：澆100 mL印度梨形孢菌液。每處理重復5次，每重復3株煙苗。50 d后隨機挑選煙株上、中、下3片煙葉，采用光合作用測定儀（LI-6400，美國LI-COR 公司）測定凈光合速率，以及單葉鮮質量、單葉長和寬，然后將煙葉烘干后稱其干質量；同時測量每株煙的株高，并計算其平均值。

1.3 數據處理

采用Excel 2007 和SPSS 17.0 進行數據的統計分析。用Duncan’s新復極差（DMRT）法進行多組樣本間的差異顯著性檢驗；用t檢驗（Student’st-test）進行兩組數據間的比較，P<0.05 水平作為差異顯著的標準。

2 結果與分析

2.1 印度梨形孢和立枯絲核菌的生長動態

印度梨形孢和立枯絲核菌的生長動態測定結果（圖1）表明：印度梨形孢和立枯絲核菌的菌落大小與培養時間均呈線性關系，但印度梨形孢的生長速率顯著低于立枯絲核菌。其中，印度梨形孢和立枯絲核菌菌落布滿培養皿（ ＝15 cm）分別需要20和7 d。

圖1 印度梨形孢（A）和立枯絲核菌（B）的生長動態Fig.1 Growth dynamic of Piriformospora indica（A）and Rhizoctonia solani（B）

2.2 印度梨形孢與立枯絲核菌的平板對峙

在PDA 平板上接種印度梨形孢5 d 后再對峙接種立枯絲核菌結果（圖2）表明：隨著培養時間延長立枯絲核菌菌落明顯增大，但印度梨形孢生長緩慢。其中，立枯絲核菌培養第1天和第2天的菌落直徑顯著小于印度梨形孢培養第6天和第7天的菌落直徑，但是立枯絲核菌培養第3天的菌落直徑卻顯著大于印度梨形孢培養第8天的菌落直徑。

2.3 混菌法培養印度梨形孢后接種立枯絲核菌對其生長的影響

對照立枯絲核菌在PDA 培養基上持續增長（圖3A），培養第5天可布滿整個培養皿，見圖3A、圖3B。然而，混菌法先培養印度梨形孢5 d后再接種立枯絲核菌，持續觀察5 d均未發現立枯絲核菌生長（圖3A、圖3C）。后續持續觀察仍未見立枯絲核菌的生長。

圖3 混菌法培養印度梨形孢后接種立枯絲核菌對立枯絲核菌生長的影響Fig.3 Effect of PDA medium mixed with P.indica on growth of R.solani after inoculation

2.4 印度梨形孢在煙草根系的定殖檢測

澆灌印度梨形孢菌液后第5、10和15 天，在煙草根系中均未檢測到印度梨形孢定殖，但在第20 天檢測到印度梨形孢的厚垣孢子存在于煙草根系的細胞內或細胞間（圖4），表明印度梨形孢已定殖于煙株根系中。

圖4 印度梨形孢在煙草根系中的定殖檢測Fig.4 Colonization detection of Piriformospora indica on roots of tobacco plant

2.5 印度梨形孢誘導煙草對靶斑病抗性的影響

CK1 和Pi 處理均未見發病癥狀，而其他3 個處理接種立枯絲核菌的煙草均存在不同程度的發病現象。其中，20Pi+Rs處理的病斑最小，顯著低于Pi+Rs和Rs處理的病斑，但Pi+Rs和Rs處理煙苗的病斑差異不顯著（P＞0.05）。另外，隨著培養時間的延長，3個發病處理病斑的直徑均持續增大，但Pi+Rs 和Rs處理病斑直徑的增長速率更快，見圖5。

圖5 不同處理對煙草靶斑病病斑大小的影響Fig.5 Effects of different experimental treatments on target spot size on tobacco leaves

2.6 印度梨形孢誘導對煙草抗病生理指標的影響

20Pi+Rs處理煙葉的CAT、POD、SOD、PAL酶活和Pro 含量均最高且顯著高于其他處理，MDA 含量最低且顯著低于其他處理；CK1 組煙葉的CAT、POD、SOD、PAL酶活和Pro含量均最低；Rs組煙葉的MDA含量最高，見圖6。

圖6 印度梨形孢和立枯絲核菌對煙草抗病生理指標的影響Fig.6 Effects of Piriformospora indica and Rhizoctonia solani on physiological indexes of tobacco

2.7 印度梨形孢對煙草生長的影響

檢測發現根系定殖印度梨形孢的煙草葉綠素含量、株高、單葉鮮質量、單葉干質量、葉長和葉寬均顯著高于未定殖印度梨形孢的煙株，見圖7。

3 討論

本研究表明，印度梨形孢和立枯絲核菌的菌落大小與培養時間均呈線性關系，但印度梨形孢的生長速率顯著低于立枯絲核菌。布滿同樣大小的培養皿，印度梨形孢需要的時間是立枯絲核菌的2.86倍。因此，研究印度梨形孢是否能夠抑制立枯絲核菌的生長時，需要提前接種印度梨形孢，待其生長穩定后再接種立枯絲核菌。

印度梨形孢在PDA 上培養5 d 可形成比較規則且厚實的菌落。因此，在進行平板對峙或混菌法抑菌時，先將印度梨形孢培養5 d，再接種立枯絲核菌。根據平板對峙試驗發現，立枯絲核菌第3 天的菌落直徑已顯著超過印度梨形孢第8 天的菌落直徑，雖然與印度梨形孢接觸的一側存在抑制現象，但未見明顯的抑制圈，這種抑制作用可能并非印度梨形孢的次生代謝產物所為，而是印度梨形孢提前培養，占據了立枯絲核菌的生態位，阻止其“越界”生長。然而，本研究中通過混菌法培養印度梨形孢5 d后再接種立枯絲核菌，發現立枯絲核菌不能正常生長，說明印度梨形孢能夠顯著抑制立枯絲核菌生長，其抑菌機理有待進一步研究。

印度梨形孢定殖在植物根系表面和表皮細胞內，能夠促進植物吸收營養并增強其抗逆性［26］。本研究結果表明，接菌20 d 后在煙草根系細胞內或細胞間可清楚地觀察到其厚垣孢子，暗示著印度梨形孢已定殖于煙草根部。

印度梨形孢定殖于大麥根系，白粉病的發病率下降58%［27］；定殖于番茄根系，黃萎病的發病率降低30%［28］。本研究結果表明，在煙苗根系澆灌印度梨形孢菌液20 d 后再在葉片接種立枯絲核菌，接種部位發病，但病斑直徑顯著小于Pi+Rs 組和Rs 組，而Pi+Rs 組和Rs 組病斑直徑差異不顯著，暗示著印度梨形孢定殖于根系才能提高煙草對靶斑病的抗性，或抑制靶斑病病斑的快速生長。因此，采用印度梨形孢預防煙草靶斑病時，應在煙株發病前將其定殖于煙草根系，以增強煙株的抗病能力。

根系定殖印度梨形孢，可增強玉米對根腐病的抗性，其機理與玉米葉片過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性顯著提高密切相關［29］。同樣，根系定殖印度梨形孢，也能顯著增強大麥對白粉病的抗性，其機理與大麥葉內抗氧化酶活的增強顯著相關［30］。另外，根系定殖印度梨形孢后接種長柄鏈格孢（Alternarialongipes），煙葉中MDA含量顯著降低，Pro含量顯著升高［14，31］，與本研究結果一致。本研究中還發現，定殖印度梨形孢的煙草接種立枯絲核菌后，其體內CAT、POD、SOD 和PAL 4 種常見酶活和Pro 含量均顯著高于根系未定殖印度梨形孢的煙株，進一步證明根系定殖印度梨形孢之所以能夠抑制煙草靶斑病病斑的快速增長，與其提高煙葉抗氧化能力有關。

植物體中的葉綠素含量與光合作用有著密切關系。通常情況下，葉綠素含量越高，植物的光合效率也越高［13］。本研究中發現，根系定殖印度梨形孢的煙草葉綠素含量顯著高于未定殖印度梨形孢的煙草，與前人研究結果一致［32］。同時，前人研究表明，接種印度梨形孢能夠提高四九黃菜心［33］、番茄［34］等的產量。本研究中也得到一致的結果，即根系定殖印度梨形孢的煙株株高、單葉鮮質量、單葉干質量、葉片長和葉片寬均顯著高于未定殖印度梨形孢的煙株，進一步證實了印度梨形孢能夠促進煙株生長。然而，目前關于印度梨形孢促進植物生長的機理尚不明確，可能與誘導其生長激素或吸收營養物質等有關，有待進一步深入研究。

4 結論

印度梨形孢的生長速率顯著低于立枯絲核菌；印度梨形孢和立枯絲核菌混菌法培養時立枯絲核菌無法正常生長；印度梨形孢菌液澆灌20 d 后可定殖于煙草根系中，定殖的印度梨形孢可顯著抑制煙草靶斑病病斑的生長；澆灌印度梨形孢菌液后可促進煙株生長。印度梨形孢能夠抑制立枯絲核菌的正常生長，增強煙草對靶斑病的抗性。