煙草NtMYB102轉錄因子基因克隆及生物信息學分析

平文麗，孫計平，郭梅燕，孫 煥，張雪珂，李雪君*

1.河南省農業科學院煙草研究所，河南省許昌市青梅路與永昌大道交叉口 4610002.煙草行業黃淮煙區煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，鄭州市金水區花園路116 號 4500023.項城市農業科學研究所，河南省周口市項城市光武大道 466200

轉錄因子（Transcription factors，TFs）又名反式作用因子，是一類可通過與DNA順式作用元件結合激活或者抑制基因的轉錄從而調控植物生長發育的蛋白，在植物調控基因表達、響應外界刺激的過程中發揮重要作用［1］。植物中與響應生物脅迫和非生物脅迫密切相關的轉錄因子主要有MYB、bZIP、WRKY、NAC 和AP2/ERF 5 個家族［2-7］。其中，MYB轉錄因子家族成員最多。MYB 轉錄因子由位于N端的DNA 結合結構域（DNA binding domain）、調控激活結構域（Transcriptional activation domain）以及負調控區（Negative regulatory region）組成。根據包含保守結構域的數量，MYB 轉錄因子被分為1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB 和4R-MYB 4類［3-6］。其中，R2R3-MYB類轉錄因子數量最多。研究發現，R2R3-MYB 類轉錄因子中的AtMYB102 可參與調控擬南芥對鹽脅迫、干旱脅迫、機械傷害、滲透脅迫、菜青蟲取食的響應，并能調控擬南芥正常生長與響應脅迫之間的動態平衡［6-14］，水稻、番茄等其他植物中MYB102 也有相似功能。Zhu 等［15］采用農桿菌介導的遺傳轉化法將AtMYB102基因在擬南芥中過量表達獲得過表達（MYB102-OX）株系，通過對比過表達株系和缺失突變體（myb102）株系接種蚜蟲后內源乙烯含量、單株蚜蟲數、NtMYB102基因及乙烯生物合成基因等的相對表達量，發現過表達AtMYB102基因可導致擬南芥易受蚜蟲為害；Piao等［16］發現水稻中OsMYB102基因可通過下調脫落酸合成延緩葉片衰老，在擬南芥中過表達OsMYB102基因可導致擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫更敏感；Zhang 等［17］在番茄中過表達SlMYB102基因，發現SlMYB102基因受滲透脅迫誘導表達后可提高番茄對鹽脅迫的抗性。然而，煙草中NtMYB102基因的相關研究尚未見報道。為此，同源克隆NtMYB102基因，使用在線工具預測NtMYB102 蛋白的理化性質與結構域以及NtMYB102基因上游順式作用元件；下載NCBI SRA數據庫中轉錄組原始數據，分析煙草接種青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum，青枯病病原菌）后NtMYB102基因的表達量，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法分析煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達量變化，以期為煙草抗病蟲育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

序列克隆中使用的煙苗（煙草品種K326）于LRH-800-GSI 型光照培養箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）中培養，條件設置為溫度25 ℃，光照8 h/d。接種蚜蟲試驗中的供試煙苗（煙草品種中煙100）按照國家標準GB/T 25241.1—2010［18］中漂浮育苗的方法培養于河南省農業科學院煙草研究所育苗大棚中。

1.2 試驗方法

1.2.1NtMYB102基因的克隆

在擬南芥信息資源中心（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥AtMYB102 蛋白的氨基酸序列，并將下載的序列在NCBI 和茄科植物基因組數據庫（https：//solgenomics.net）中分別進行BLAST比對，獲得與AtMYB102 蛋白相似度最高的煙草NtMYB102基因序列，根據序列設計NtMYB102基因特異引物102F（5'-ATGGGAAGAGCTCCTTGTTGTG-3'）和102R（5'-GACTTACATAAATTCATTAGTGG-3'）。使用RealPure 普通植物RNA 提取試劑盒［中科瑞泰（北京）生物科技有限公司］提取K326幼苗的mRNA后，使用All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix（with dsDNase）反轉錄試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）合成cDNA 并將其作為模板，以102F和102R 作為擴增引物，使用2×SanTaq PCR Mix 試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］進行PCR 擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產物。將PCR 產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司，由該公司采用Sanger 測序法獲取NtMYB102基因的CDS序列。

1.2.2NtMYB102基因及編碼蛋白的生物信息學分析

使用在線工具Translate（https：//web.expasy.org/translate）將NtMYB102基因的CDS 序列翻譯為蛋白序列，并使用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和在線工具ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白理化性質。從茄科植物基因組數據庫中下載NtMYB102基因上游2 000 bp 的序列。使用在線工具NNPP（Neural Network Promoter Prediction，https：//fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）分析NtMYB102基因上游2 000 bp 的轉錄起始位點；使用在線工具NSITE-PL（http：//www.softberry.com/berry.phtml？topic=nsitep&group=programs&subgroup=promoter）與順式作用元件數據庫PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分別分析NtMYB102基因上游2 000 bp 的啟動子順式作用元件。使用在線工具 SignalP 6.0 （https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0）預測蛋白信號肽。使用在線工具TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測跨膜結構域。使用在線工具Motif search（https：//www.genome.jp/tools/motif/）和在線工具InterProScan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/about/interproscan/）分析蛋白的結構域、基序（Motif）和所屬家族。其中，在線工具Motif search 的檢索范圍為Pfam、NCBI-CDD、Prosite profile 3 個網站。使用蛋白結構預測軟件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）、在線工具PredictProtein（https：//predictprotein.org）和SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）分析蛋白二級結構和3D 結構。使用在線工具NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測蛋白磷酸化修飾位點。從茄科植物基因組數據庫及本氏煙基因組數據庫（http：//benthgenome.qut.edu.au/）下載獲得番茄、茄子、馬鈴薯和本氏煙等茄科植物的MYB102 蛋白序列，并采用最大似然（Maximum Likelihood）法使用MEGA 11.0 軟件構建系統進化樹。

1.2.3 煙草接種青枯雷爾氏菌后NtMYB102基因的表達量分析

使用SRA-Toolkit 軟件（https：//github.com/ncbi/SRA-tools）從NCBI SRA 數據庫中下載抗煙草青枯病品種巖煙97 和感煙草青枯病品種紅花大金元接種青枯雷爾氏菌后的轉錄組數據（SRA ID 為SRP423092）。將原始數據轉換為標準的FASTQ格式文件后，使用fastp軟件對數據進行質控［19］。使用HISAT2 軟件將質控后的數據映射至煙草參考基因組，參數設置參考文獻［20］。使用SAMtools 軟件對映射結果進行格式轉換、排序，并使用StringTie 軟件對轉錄本進行組裝和量化［21-22］；使用StringTie 軟件的Python 腳本prepDE.py（https：//ccb.jhu.edu/software/StringTie/dl/prepDE.py）獲得原始reads 計數［22］。使用Ballgown 軟件計算標準化的基因表達量［TPM（Transcripts Per Million）值］［23］。提取轉錄組數據中NtMYB102基因的TPM 值，分析煙草接種青枯雷爾氏菌后12、24、36 和120 h 感病品種和抗病品種中NtMYB102基因的表達量與0 h 的差異。

1.2.4 煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達量分析

供試煙苗（中煙100）在育苗大棚中采用漂浮育苗法培養至3～4 片真葉時，移栽到花盆中培養，每盆1 株，接種18 株。至7～8 片真葉時，選擇整齊一致的煙苗，外罩防蟲網（孔徑0.15 mm），在煙苗最頂部的3 片葉上接種蚜蟲，每株接種4 齡無翅成蚜20 頭。在接種蚜蟲后0、6、12 和24 h 取接種葉片，分析NtMYB102基因的相對表達量變化，試驗設置3 次生物學重復，RNA 提取使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 試劑盒（日本TaKaRa公司）、cDNA 合成使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）。根據ABI 7500 Fast 型實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）操作說明及TB Green?PremixEx TaqTM試劑盒（日本TaKaRa 公司）的說明書進行實時熒光定量PCR 分析。以NtActin基因作為內參，采用2-△△CT法［24］計算NtMYB102基因相對表達量。用于分析NtMYB102基因相對表達量的引物序列為q-F（5'-GCTGGACTTCAAAGGTGTGG-3'）和q-R（5'-GCAGCAATAGCAGACCACTT-3'）。使用DPS 14.5 軟件對相對表達量進行方差分析，采用LSD 法進行數據間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 NtMYB102基因的克隆

以K326幼苗cDNA為模板進行PCR擴增后，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產物，發現PCR 產物的長度約為1 100 bp（圖1）。Sanger 測序的結果表明，NtMYB102基因CDS 序列全長1 131 bp，序列與NCBI和茄科植物基因組數據庫中一致。

圖1 NtMYB102基因CDS區的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis map for CDS region in NtMYB102 gene

2.2 NtMYB102基因編碼蛋白的理化性質

使用在線工具Translate 將NtMYB102基因的CDS 區翻譯為蛋白，發現該基因無內含子，編碼的蛋白由376 個氨基酸組成。使用在線工具ProtParam 對NtMYB102 蛋白基本理化性質進行分析，發現該蛋白分子量為42.817 kDa，理論等電點為5.77，分子式為C1859H2874N534O596S18，由5 881個原子組成，不穩定指數為50.35，在植物體內為不穩定的蛋白。根據在線工具ProtScale對NtMYB102蛋白疏水性的分析結果，NtMYB102蛋白的親水區域（疏水性標度值為負值）多于疏水區域（疏水性標度值為正值），表明NtMYB102蛋白是一種親水蛋白（圖2）。

圖2 NtMYB102蛋白的疏水性預測結果Fig.2 Predicted hydrophobicity of NtMYB102 protein

2.3 NtMYB102基因啟動子和順式作用元件預測

使用在線工具NNPP 對NtMYB102基因轉錄起始位點進行預測，發現NtMYB102基因啟動子序列為5'-ATCCTCCCTATATATATACCCCCTCCCCTTAT TCTTAATCTCCAGCAATA-3'，其中加下劃線的T為轉錄起始位點。使用在線工具Nsite-PL及數據庫PlantCare 對NtMYB102基因上游2 000 bp 順式作用元件進行預測，發現在NtMYB102基因的上游存在多個轉錄因子結合位點。其中，-1 607 bp 至-1 614 bp 為依賴 ABA 的脅迫響應元件 ABRE（TACGTGGC）；-1 577 bp 至-1 585 bp 及-188 bp至-196 bp 為與防御和脅迫相關的響應元件TC-rich repeats（GTTTTCTTAC）；-1 304 bp至-1 310 bp為參與調控植物抗病相關基因表達的元件GCC-box（AGCCGCC）；-521 bp 至-526 bp 為響應水分脅迫、鹽脅迫、滲透脅迫及ABA 的元件Myba（CGGTTG）；-205 bp 至-210 bp 為真菌誘導響應元件W-box（TTGACC）。

2.4 NtMYB102蛋白的信號肽和結構域預測

在線工具SignalP 6.0 對NtMYB102 蛋白的預測結果表明，該蛋白不存在信號肽。在線工具TMHMM 對跨膜結構的預測結果表明，NtMYB102蛋白無跨膜區。使用在線工具Motif search 和InterProScan 對NtMYB102 蛋白的結構域、基序和所屬家族進行分析，結果如圖3所示。Prosite profile網站中檢索到1 個具有DNA 結合位點特征的HTH_MYB motif，NBCI-CDD 網站中檢索到9 個具有DNA 結合功能的SANT/MYB motif，Pfam 網站中檢索到4個具有DNA結合功能的Myb_DNA-bingding motif。在線工具InterProScan對NtMYB102蛋白的分析發現，該蛋白為DNA結合蛋白，屬于MYB 家族，具有2 個Myb_DNA-binding保守結構域。

圖3 NtMYB102蛋白的結構域及基序預測結果Fig.3 Predicted domains and motifs of NtMYB102 protein

2.5 NtMYB102蛋白二級結構和3D結構預測

使用Phyre2軟件對NtMYB102蛋白的二級結構和3D結構進行預測，發現該蛋白存在α螺旋，無β折疊鏈；蛋白的3D 結構中有多個螺旋結構（圖4）。使用在線工具PredictProtein 和SWISS MODEL 對NtMYB102 蛋白的二級結構和3D 結構的預測結果與Phyre2軟件的預測結果一致。

圖4 NtMYB102蛋白的二級結構和3D結構Fig.4 Secondary structure and 3D structure of NtMYB102 protein

2.6 NtMYB102蛋白磷酸化修飾位點預測

對NtMYB102 蛋白的磷酸化位點進行預測，發現該蛋白存在大量可被磷酸化的位點（圖5）。其中，評分最高的3 個磷酸化位點為位于第71、355 和347 個氨基酸的絲氨酸，評分分別為0.998、0.996 和0.994 分。NtMYB102 蛋白可能通過上述位點發生磷酸化修飾的方式參與細胞內信號轉導、調控基因的轉錄表達。

圖5 NtMYB102蛋白中磷酸化位點的預測結果Fig.5 Predicted phosphorylation sites in NtMYB102 protein

2.7 NtMYB102蛋白氨基酸序列同源性比對和系統進化分析

對NtMYB102 蛋白序列以及本氏煙、茄科其他近緣種（辣椒、茄子等）和棉屬植物等的MYB102 同源蛋白氨基酸序列進行多重序列比對并構建系統進化樹，發現NtMYB102 蛋白與本氏煙中NbMYB102 蛋白的親緣關系最近，與辣椒和茄子等其他茄科作物MYB102 蛋白的親緣關系較近，與擬南芥、大豆、棉花和茶樹等其他植物的親緣關系較遠（圖6）。

圖6 MYB102蛋白的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of MYB102 protein

2.8 煙草接種青枯雷爾氏菌后NtMYB102基因的表達量變化

接種青枯雷爾氏菌后，抗病和感病煙草品種的NtMYB102基因表達量（TPM 值）變化如圖7 所示。抗病煙草品種巖煙97 接種青枯雷爾氏菌后12 hNtMYB102基因的表達量高于0 h，但差異未達顯著水平；接菌后24、36 和120 hNtMYB102基因的表達量均低于0 h。其中，接菌后36 hNtMYB102基因的表達量與0 h 比差異顯著（P<0.05）。感病品種紅花大金元接種青枯雷爾氏菌后12和24 hNtMYB102基因的表達量高于0 h。其中，接菌后24 hNtMYB102基因的表達量與0 h差異達顯著（P<0.05）水平；接菌后36和120 hNtMYB102基因的表達量與0 h無顯著差異。

圖7 接種青枯雷爾氏菌后巖煙97及紅花大金元中NtMYB102基因表達量Fig.7 Expression level of NtMYB102 gene in Yanyan 97 and Honghuadajinyuan after being infected by R.solanacearum

2.9 煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達量變化

采用實時熒光定量PCR 法分析煙草接種蚜蟲后NtMYB102基因的相對表達量，發現接種4齡無翅成蚜后6、12 和24 h，煙草NtMYB102基因的相對表達量均極顯著（P<0.01）高于0 h（圖8）。接種后6 h，NtMYB102基因的相對表達量為4.58；接種后12 h，相對表達量為5.00；接種后24 h，相對表達量為6.46。接種后24 h，NtMYB102基因的相對表達量極顯著（P<0.01）高于接種后0、6 和12 h；接種后6 和12 h 的相對表達量間無顯著差異。綜上，NtMYB102基因能夠在接種蚜蟲后6～24 h 快速響應，相對表達量顯著上調，表明該基因在轉錄水平響應蚜蟲取食，可能參與煙草抗蟲性的調控。

圖8 接種蚜蟲后煙草NtMYB102基因的相對表達量Fig.8 Relative expression of NtMYB102 gene in tobacco after aphids infestation

3 討論

本研究中發現NtMYB102基因上游2 000 bp 包含了多種響應逆境脅迫以及調控植物中與病原菌侵染誘導和防御相關基因的順式作用元件（ABRE、TC-rich repeat、GCC box、BREB 和W-box），表明該基因可能受病原侵染和逆境脅迫的誘導，這與擬南芥、水稻和番茄等植物中關于MYB102基因功能研究的結果一致［25-27］。根據對NCBI SRA 數據庫中轉錄組原始數據的分析結果，抗煙草青枯病品種接種青枯雷爾氏菌后36 h，NtMYB102基因的表達量顯著（P<0.05）低于0 h，這與劉徹等［28］的研究結果一致。接種青枯雷爾氏菌后，抗病和感病煙草品種NtMYB102基因的表達量變化趨勢不同，表明NtMYB102基因是抗病和感病煙草品種中響應病原菌侵染的差異表達基因，可能在調控煙草對青枯病抗病性中起重要作用。后續研究可采用基因組編輯技術對NtMYB102基因的表達量進行精準調控，驗證NtMYB102基因功能，然后使用基因組編輯技術對感青枯病煙草品種進行定向改良。此外，中煙100 接種蚜蟲后6、12 和24 h，NtMYB102基因的相對表達量持續上調，且均顯著（P<0.05）高于0 h，該趨勢與擬南芥被蚜蟲取食后AtMYB102基因的表達變化規律一致［15］，推測NtMYB102基因可能參與煙草響應蚜蟲取食，可作為抗蚜蟲育種的候選基因。

4 結論

從煙草K326中克隆了擬南芥AtMYB102的同源基因NtMYB102。煙草NtMYB102基因的CDS 全長1 131 bp，編碼376 個氨基酸。生物信息學分析結果表明，NtMYB102基因的上游2 000 bp 存在多個響應脅迫、響應真菌誘導和與防御相關的順式作用元件。接種青枯雷爾氏菌后36 h，抗病煙草品種中NtMYB102基因的表達量顯著下調，表明該基因可能在煙草響應青枯雷爾氏菌侵染中起調控作用。煙草接種蚜蟲后6～24 h，NtMYB102基因的相對表達量顯著提高，表明該基因可能在煙草響應蚜蟲取食中起調控作用。