血液免疫項目ELISA 法檢測中采用EDTA-K2 抗凝劑、枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的作用研究

高攀 張耀東 肖波濤 鄧偉

根據血站基本標準、血站管理辦法等方式, 采集患者血液后進行各項檢測, 例如抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-TP ELISA 法檢測, 檢測時各個項目分別采用兩個不同的廠家試劑［1］, 國內采供血機構常規采用三種雙孔復檢模式, 主要有雙孔復檢血袋上的辮血、雙孔復檢留樣抗凝試管血、同時復檢抗凝試管血和辮血, 最終檢測結果要經過雙孔復檢對ELISA 法初檢結果的樣本進行確認。根據各項研究顯示, ELISA法檢測全自動酶疫分析系統為國內采供血機構所廣泛使用, 在每次血液采集完畢后要留樣, 采血留樣按規定要用抗凝血, 抗凝劑主要采用乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素抗凝劑［2］。本項目在研究過程中采用EDTA-K2、抗凝試管血與辮血同時做復檢, 同一個獻血者同次采血中發現辮血與抗凝試管血的結果出現不同, 經過摸索實驗, 改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑, 并進行比較實驗［3］。因此, 本次研究對血液免疫項目ELISA 法檢測中采用EDTA-K2抗凝劑、枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的作用進行分析。

1 材料與方法

1.1 材 料 收 集本 中 心2017 年8 月～2021 年9 月無償獻血者48689 份樣本, 首先按常規采集凝固血, 然后吸取部分血樣分別用EDTA-K2抗凝劑和枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 試劑：采用新創和萬泰公司生產的抗-HIV 試劑、抗-HCV 試劑、HBsAg、抗-TP 試劑；達安的HBV 基因擴增試劑。儀器：瑞士Hamilton FAME 全自動免疫分析系統及STAR、AT 全自動加樣儀；賽默飛Q5 PCR 擴增儀。

1.2.2 樣本處理與檢測 吸取血樣5 ml 分別加入到裝有EDTA-K2抗凝管(含EDTA-K25 mg/m1 血樣)和枸櫞酸鈉(48 mg/ml 血樣)-枸櫞酸(1.7 mg/ml 血樣)的抗凝管內顛倒混勻8～10 次, 待血液凝固后離心分離血清, 分別用新創和萬泰的ELISA 試劑同時進行抗-HIV、抗-HCV、HBsAg 及抗-TP 檢測［4］, 對檢測結果樣品的吸光度(S)/標準的吸光度(CO)>1 判定為陽性。將EDTA-K2抗凝劑改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑, 將兩種陽性樣本采取HBV-PCR 法進行復檢, 復檢樣本為采樣血袋上的血辮, 由辮血進行HBV-PCR 擴增確定最終結果［5］。

1.3 觀察指標 統計不同廠家兩種抗凝血液樣本的陽性標本數量, 分析辮血復檢結果。

2 結果

新創廠家生產的EDTA-K2抗凝檢出抗-HIV 陽性71 例(0.15%), 抗-HCV 陽性628 例(1.29%), HBsAg 陽性784 例(1.61%), 抗-TP 陽性72 例(0.15%)；枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝檢出抗-HIV 陽性57 例(0.12%), 抗-HCV陽性414 例(0.85%), HBsAg 陽性652 例(1.34%), 抗-TP陽性44 例(0.09%)。萬泰廠家生產的EDTA-K2抗凝檢出抗-HIV 陽性65 例(0.13%), 抗-HCV 陽性511 例(1.05%), HBsAg 陽性721 例(1.48%), 抗-TP 陽性72 例(0.15%)；枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝檢出抗-HIV 陽性56 例(0.12%), 抗-HCV 陽性467 例(0.96%), HBsAg 陽性623 例(1.28%), 抗-TP 陽性47 例(0.10%)。見表1。將EDTA-K2抗凝劑改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑后,對所有陽性樣本采取HBsAg 做PCR 復檢陽性率, 新創、萬泰陽性檢出率分別降到了1.35%(657/48689)和1.33%(647/48689)。

表1 不同廠家ELISA 法檢測兩種抗凝血液樣本的陽性標本數量分析［n(%)］

3 討論

本研究中ELISA 法檢測是基于抗原抗體反應, 高濃度抗原、抗體拖帶等因素造成檢驗結果產生假陽性,或者僅采用抗凝試管血的情況下, 因為抗凝劑的干擾也會導致假陽性結果的出現。僅采用辮血或抗凝試管血報告結果, 相同血型間交叉留樣造成干擾的問題在采血過程中沒有辦法避免, 這樣就不能及時查找原因和發現問題, 從而發生陽性樣本漏檢的情況［6,7］。對陽性樣本辮血進行復檢, 有研究表明辮血實際上歸類為血清, 辮血儲存時可能會混入少許ACD 保存液, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉為ACD 保存液成分之一。目前市場上的檢驗試劑顯示血清和血漿都可以適用, 但在實際工作中普遍發現檢測結果還是有明顯差異性, 例如在復檢時無論是單做辮血檢測還是單做抗凝試管血檢測, 由于抗凝劑的干擾和影響, 可能抗凝試管血與辮血混入的抗凝劑并不一致, 導致無法得到真實結果, 可見在檢驗過程中選擇適宜抗凝劑及采用正確的復檢模式非常必要［8,9］。

本研究中采用兩個廠家試劑分別采用ELISA 法檢測抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、抗-TP, 結果顯示EDTA-K2抗凝劑對同一廠家不同項目試劑都出現干擾問題, 但兩者沒有明顯差異［10］, 對同一廠家不同項目試劑, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑沒有產生明顯干擾。以往研究證實, 采用EDTA-K2抗凝劑會干擾抗-TP ELISA 法檢測產生假陽性結果［11］, 綜合各方面數據分析得知, EDTA-K2對血液HBsAg、抗-TP、抗-HCV、抗-HIV 檢測結果都產生明顯干擾, 其中以抗-TP、抗-HIV 表現尤為突出；對HBsAg、抗-HCV, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑產生的干擾明顯很少。不同抗凝劑對ELISA 法的檢測結果影響較大［12］。經統計相關報告,抗凝劑EDTA-K2改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉后的重復反應性結果中, 抗凝試管血與辮血結果不一致的情況明顯減少, 因此對上述情況需要進一步積累樣本量、擴大統計數據進行分析。用ELISA 法檢測, 其影響測定結果的因素較多, 主要有標本因素、試劑因素、操作因素等, 在研究中主要討論標本因素中抗凝劑對ELISA法檢測結果的影響。在本次研究中, 這兩種方式具有顯著差異, 原因是抗原和抗體反應的結構基礎在抗凝劑的抗凝過程中沒有受到影響, 由于抗體實際上是免疫球蛋白, 抗體與特異性抗原發生反應的結構基礎就是免疫球蛋白的可變區中氨基酸排列順序呈高度變異性［11, 13］。

本次研究結果顯示, EDTA-K2改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑后, 通過統計復檢結果顯示EDTA-K2抗凝試管血結果與復檢辮血的陽性率明顯降低, 而采用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑陽性率變化不明顯, 表明EDTA-K2抗凝劑對ELISA 法檢測結果的影響比枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的干擾更顯著。

綜上所述, EDTA-K2 抗凝劑對ELISA 法檢測結果的影響較枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的干擾更明顯。