不同植物搭建人工濕地的根系分泌物組成及其對養殖尾水的處理效果

蔣俊賢，張 凱，王廣軍，郁二蒙，龔望寶，李志斐，謝 駿

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東省水產動物免疫技術重點實驗室，廣州 510380)

隨著水產養殖規模及集約化程度不斷擴大，水產養殖尾水排放逐漸引起人們的重視。MOURA等[1]發現，水產養殖池塘中投入生產的近79%的N和83%的P隨尾水排出。雖然水產養殖尾水相比畜禽業、工業、生活污水污染較低，但是其較低的碳含量和較高的硝酸鹽濃度對水產養殖尾水的凈化造成不小的挑戰。在低碳氮比的尾水處理過程中，碳源的缺乏會導致硝化和反硝化細菌活性低下、生長速度緩慢進而影響處理效果[2]。實踐證明，人工濕地種植植物能顯著提高對污染物的去除率。雖然植物對水體中主要污染物氮磷的直接去除率不高，但是植物可以通過根系釋放的分泌物及根系泌氧，在根際形成交替的有氧與無氧環境，進而影響根際微生物群落結構，調節污水處理效果[3]。

植物向根際區釋放的分泌物的組成受植物種類、基因型、發育階段、根系性狀、養分有效性和環境等條件影響[4]。鳶尾(IristectorumMaxim)和風車草(CyperusinvolucratusRottboll)是兩種常用于人工濕地的植物，它們對環境適應性強，根系發達，對氮、磷的吸收效果較強[5]。已有研究表明，鳶尾或風車草釋放的根系分泌物種類有乳酸、酒石酸、腐殖酸、色氨酸、草酸、蘋果酸、多糖、氨基酸等[6-8]，且部分根系分泌物有利于尾水中TN和TP的去除。然而，這些研究多是定向檢測已知的植物分泌物種類，且處理的尾水多為高氨氮廢水，與水產養殖尾水有著較大差異。人工濕地植物在處理水產養殖尾水時分泌物釋放情況以及根系分泌物與其處理效果之間的關系鮮有報道。

因此，本研究通過搭建由鳶尾和風車草組成的垂直流人工濕地處理模擬水產養殖尾水，通過超高效液相色譜串聯質譜檢測其根系分泌物釋放情況并分析其與污染物去除率之間的聯系，以期為強化人工濕地處理水產養殖尾水效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 人工濕地搭建

實驗于中國水產科學研究院珠江水產研究所芳村基地進行。使用有機玻璃為原材料的圓柱體(直徑20 cm，高50 cm)搭建垂直流人工濕地。填充材料為沸石、陶粒、椰殼炭的混合物，混合比例為1∶1∶2[9]，基質鋪設高度為35 cm，濕地水深40 cm。共設置3個實驗組，不種植植物的濕地(NP)為對照組，種植植物為鳶尾(YW)或風車草(FCC)的濕地為處理組，植物種植密度約為31株/m2(圖1)，每組有3個平行。

圖1 人工濕地裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of constructed wetland

1.2 濕地運行與水質檢測

1.3 根系分泌物收集與檢測

根系分泌物收集方法參考MA等[6]的方法，用超純水輕輕沖去植物根部黏附的基質與死亡的植物組織，之后將根部置于400 mL超純水中用錫箔紙避光培養12 h。培養后的溶液通過0.45 μm濾膜過濾以除去雜質，用旋轉蒸發儀在45 ℃減壓濃縮至20 mL，于-20 ℃保存待上機檢測。樣品中加入10 μL 100 μg/mL內標，過0.22 μm PTFE濾頭上機檢測。使用超高效液相色譜儀(Thermo Vanquish UHPLC)，色譜柱：C18色譜柱[Zorbax Eclipse C18(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)]，色譜分離條件為：柱溫為30 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：0.1%甲酸水溶液，B：純乙腈，流動相梯度洗脫程序見表1；進樣量為2 μL，自動進樣器溫度4 ℃。質譜條件：正(負)模式：加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；吹掃氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。掃描模式：一級全掃描(Full Scan，m/z100～1 500)與數據依賴性二級質譜掃描(dd-MS2，TopN=10)；分辨率：120 000(一級質譜)&60 000(二級質譜)。碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)。根據各樣品中代謝物的峰面積，計算其在樣品中相對濃度。

表1 液相色譜流動相條件Tab.1 LC mobile phase conditions

1.4 統計分析

用IBM SPSS 26.0對各測定數據進行統計分析與Pearson相關系數的計算，結果以平均值±標準差表示，P<0.05被認為有顯著差異，并用鄧肯多重比較進行排序。圖形采用origin 2022繪制。

2 結果

2.1 不同植物人工濕地對尾水的凈化效果

圖2 不同植物組出水N的濃度Fig.2 Effluent nitrogen concentration of different groups

圖3 不同植物組對N的去除率Fig.3 Nitrogen removal efficiency of different groups不同小寫字母標注表示平均去除率差異顯著，P<0.05

圖4 不同植物組對COD和TP的平均去除率Fig.4 Average COD and TP removal efficiency of different groups不同小寫字母標注表示差異顯著，P<0.05

2.2 根系分泌物

兩種植物的根系分泌物共分離檢測出249種物質，其中正離子模式下有145種，負離子模式下有104種。其中3個平行中均檢測到并且具有CAS號(Chemical Abstracts Service Registry Number)的化合物有84種，可歸為28類：苯并吡喃(No.1)，苯酚醚(No.2)，苯及其取代衍生物(No.3～9)，吡啶及其衍生物(No.10～11)，大環內酯類及其類似物(No.12)，二嗪(No.13～14)，二嗪烷(No.15)，酚類(No.16～17)，呋喃(No.18)，黃酮類化合物(No.19～20)，類固醇和類固醇衍生物(No.21～24)，硫醚(No.25)，咪唑嘧啶類(No.26～28)，嘧啶核苷(No.29～31)，萘并呋喃類(No.32)，內酰胺(No.33)，偶氮苯(No.34)，嘌呤核苷(No.35～36)，羥基酸及其衍生物(No.37)，肉桂酸及其衍生物(No.38～39)，羧酸及其衍生物(No.40～52)，異黃酮類(No.53)，吲哚及其衍生物(No.54)，有機氮化合物(No.55～56)，有機磷酸及其衍生物(No.57～59)，有機氧化合物(No.60～67)，孕烯醇酮脂類(No.69～77)，脂肪酰類(No.78～84)。如表2所示，鳶尾的根系分泌物種類共有82種，風車草的根系分泌物共有24種。

表2 不同植物組根系分泌物的組成Tab.2 Composition of root exudates in different groups

2.3 根系分泌物與污染物去除率關系

圖5 不同處理組污染物去除率與根系分泌物濃度的相關性Fig.5 Correlation of pollutants removal efficiency and root exudates concentration of different groups

3 討論

3.1 根系分泌物的功能

根系分泌物本質上是植物光合作用及自身生理代謝固定轉化的含碳化合物，因此它可以作為細胞生長發育所需的能源物質。本實驗檢測出的根系分泌物在許多以往的研究中有報道，如次黃嘌呤和尿囊素可以作為一些淡水綠藻生長的氮源[11]；萊茵衣藻可以利用腺嘌呤和鳥嘌呤作為氮源[12]；吳海露[13]將植物根系浸泡得到的根系分泌物濃縮后加入反硝化培養基作為輔助碳源，促進了反硝化作用及反硝化微生物的生長。另外，本研究檢測出的許多根系分泌物還具有促進植物生長的作用，如2，4-二硝基苯酚能促進玉米根系代謝和吸收外源底物[14]；膽堿處理能有效地促進玉米等植物的生長[15]。根系分泌物中還檢測出多種氨基酸類化合物，氨基酸類是植物中各種酶合成的催化劑，在植物生長和代謝中起重要作用，如纈氨酸能夠促進桃幼苗的根系生長，可提高其凈光合速率和果實品質[16]；施用有機肥和L-苯丙氨酸對牛膝草的生長、產量和品質均有積極的影響[17]。

除了直接作為促生長物質，根系分泌物還可以提高植物的抗病、抗脅迫、抗應激等能力。本實驗檢測出的根系分泌物在之前的研究中展現了一定的抗菌活性，如異香草酸和扁塑藤素分別具有抗細菌和抗真菌活性[18，19]；熊果酸能特別針對細菌包膜，包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌[20]。另外，外源施用保護性植物代謝物如檸檬酸或檸檬酸鹽已成為提高植物對環境脅迫抗性的有效方法[21]，本研究測得鳶尾根系分泌物中檸檬酸相對濃度高達62.3 μg/mL，為本研究檢測出相對濃度最高的根系分泌物。結合鳶尾的良好長勢，表明檸檬酸可能發揮了重要作用。本研究中其它檢測出的根系分泌物也有著利于植物抗脅迫應激的作用，吡哆醇是胚后根發育、耐受滲透和氧化脅迫所必需的一種維生素[22]；外源煙酸的施用可增強玉米的耐旱性；熊果酸和齊墩果酸可參與植物抵御失水和病原體的防御過程[23]。

根系分泌物還能作為介導植物-微生物關系的信號分子，本研究檢測出的壬二酸可作為擬南芥莖液中病原菌誘導產生的代謝物，具有多種遠距離抗性啟動信號[24]；苯乙炔可以影響微生物群落結構[25]，也有文獻報道其是一種硝化抑制劑[26]，表明根系可能更多發生的是反硝化作用；谷氨酸在植物宿主和其微生物之間起著直接聯系作用，可重塑植物微生物群以保護植物免受病原體的侵害[27]。

3.2 根系分泌物對人工濕地處理性能的影響

多數研究表明植物對COD的去除起著積極的作用[32]。COD除了作為反硝化的碳源被利用，也能被氧化分解去除。植物的加入使得根際泌氧增加并通過根系分泌物增強了反硝化作用，進而提高了COD的去除率。鳶尾的根際泌氧較風車草低[29]，而本研究中其對COD去除率高于風車草，推測鳶尾更多地通過根系分泌物促進了反硝化作用進而去除了更多的COD。說明在一定的溶氧范圍內，人工濕地內反硝化作用比氧化分解能消耗更多的COD，因為COD的去除主要是通過微生物的作用[33]。人工濕地對P的去除主要是靠基質吸附、植物吸收和微生物的同化作用[34]。在濕地建立初期，基質吸附量未達到飽和，因此3組濕地系統對P的去除率都在80%以上。植物根系分泌的低分子量有機酸可以促進微生物對P的轉化與利用而更利于植物吸收[35]，導致種植植物組對TP的處理效果略高于未種植組。

4 結論

(1)種植植物可以顯著提高人工濕地對N，P的處理效果，不同的植物釋放的根系分泌物種類與數量有差異，并與污染物的去除有一定相關性。

(2)鳶尾根系分泌物種類與數量均占一定優勢，其對TN，TP的去除率也高于風車草，表明根系分泌物對污染物的去除有積極影響。