六價鉻對普通小球藻的急性毒性效應

余佳妮，李立杰，葛 恒，馬永華，廖木蘭，尤德雨，譚鳳霞，柴 毅1，

(1.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434025；2.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；3.長江大學農學院，湖北荊州 434025)

重金屬脅迫是近年來引起環境污染的主要非生物脅迫之一，其中鉻(Cr)是重金屬污染物之一，工業發展中燃料燃燒的含鉻廢氣、廢水和廢渣是主要的污染源[1]。目前在水體，土壤，大氣等環境介質中均檢測出Cr的存在。其中，水體是主要匯集和遠距離傳輸的載體[2]。據調查，珠江支流西江干流水體中Cr含量超三類水標準值0.92倍，高達96 μg/L[3]；寧波市城區地表水Cr污染超過地表水環境質量標準(GB 3838-2002)IV類水質標準值，導致致癌率增加[4]；滇池水體中Cr6+含量為(127.83±2.9)μg/L，超Ⅴ類水標準[5]。在水體環境中主要是以Cr3+和Cr6+這兩種形式最為常見，其中Cr6+具有難降解、致癌和致突變等特性[6]。已有研究表明，Cr6+在生理生化[7，8]、免疫[9]和遺傳[10]等各個層次上對水生生物產生毒性效應，并可通過食物鏈富集最終進入人體內損害健康。目前，Cr6+化合物已被列入我國《優先控制化學品名錄(第一批)》和《有毒有害水污染物名錄(第一批)》的危險化學物質。因此為保護生態環境和人類健康，探究水環境中Cr6+的污染特征是至關重要的。

普通小球藻(Chlorellavulgaris)屬于淡水綠藻，其適應性強，繁殖迅速、對逆境敏感、并且能吸收和積累多種環境有機物，是水體污染的指示種，被廣泛應用于污染物毒性評價和生態風險評估[11]。本實驗通過研究不同脅迫濃度Cr6+對普通小球藻的藻密度、葉綠素、氧化應激、多糖和重金屬吸附率等指標的影響，來探究Cr6+對普通小球藻的毒性效應機制，以期評估和預測重金屬Cr6+污染對水生生物的生態風險，為Cr6+對生態環境的影響評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

受試藻種：普通小球藻(Chlorellavulgaris)購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-2338。

試劑：重鉻酸鉀(K2Cr2O7)購自天津市科密歐化學試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 藻種擴培

普通小球藻采用改良后的BG11培養基(表1)培養，由于EDTA會和重金屬離子結合影響毒性效應，在培養時將EDTA從培養基移除，將pH調至7.1，滅菌(121 ℃，30 min)，接種時需在無菌條件下轉接，于恒溫光照培養箱(GZX-250BSH-Ⅲ，中國上海新苗醫療器械制造公司)靜置培養，溫度為25 ℃，光照4 000～6 000 lux，光暗比為12 h∶12 h，每日定時人工搖勻3次。

表1 BG11培養基Tab.1 BG11(Blue-Green)Medium

1.3 六價鉻對普通小球藻的毒性效應

將適量重鉻酸鉀(K2Cr2O7)溶于蒸餾水中配制成Cr6+離子的母液。根據預實驗設置Cr6+濃度為0(即CK)、0.1、0.75、1.5、2.25和3 mg/L，設三組平行。選取處在對數生長期的普通小球藻藻液，離心(3 000 r/min，15 min)，蒸餾水重懸再次離心三次收集藻細胞。在無菌條件下加入BG11和不同濃度的Cr6+進行脅迫處理。初始藻密度為1×106(初始OD680 nm=0.087)，溶液總體積200 mL，實驗周期為96 h。

1.4 藻細胞密度的測定

將藻液搖勻后采用血細胞計數板計數藻細胞，并在OD680 nm測吸光度值，隨后繪制不同藻細胞密度和吸光度值的標準曲線(y=18.986x-0.7991，R2=0.9994)。每24 h測定對照組和各脅迫組藻液的OD680 nm，生物量根據標準曲線計算出的藻密度來表示。

1.5 IC50的計算

于96 h測定培養的普通小球藻生物量，分別計算脅迫組普通小球藻生物量相對于對照培養的抑制率，并建立脅迫濃度和抑制率的線性關系，以此得出96 h-IC50。

其中：I表示抑制率；OD對照值、OD測定值分別為對照組和測定處理組在680 nm處的吸光值。

1.6 葉綠素a(Chl-a)質量濃度測定

各濃度組取5 mL藻液離心(3 000 r/min，15 min，4 ℃)后去上清液收集藻體，加入5 mL 95%的乙醇在75 ℃水浴3 min，再次離心(3 000 r/min，15 min，4 ℃)后測定665 nm和649 nm的吸光度值根據公式算出葉綠素含量[12]。

Chl-a(mg/L)=13.95A665 nm-6.88A649 nm

1.7 抗氧化酶活系統測定

各濃度組取100 mL藻液離心(3000 r/min，15 min，4 ℃)棄上清液，PBS重懸離心三次，將藻體放入冷凍干燥機(FD-1A-50，北京博醫康實驗儀器有限公司)干燥12 h，加入0.5 mL PBS緩沖溶液和0.2 g氧化鋯珠(R=0.05 mm)，低溫條件在混合型球磨儀(MM400，弗爾德上海儀器設備有限公司)破碎，5 000 r/min，3 min，低溫離心取上清液進行測定。總抗氧化能力(T-AOC，A015-2-1)，總超氧化物歧化酶(T-SOD，A001-3-2)活性、丙二醛(MDA，A003-2-2)含量、谷胱甘肽(GSH，A006-2-1)含量、非蛋白巰基(NPT，A063-4-1)含量和蛋白(TP，A045-4-2)含量均用南京建成公司試劑盒進行測定。植物螯合肽(PCs)含量=非蛋白巰基含量(NPT)-谷胱甘肽含量(GSH)[13]。

1.8 胞內多糖測定

采用蒽酮-硫酸法，提前做好葡萄糖溶液標曲。分別吸取5 mL藻液，80 ℃水浴加熱30 min，離心(3 000 r/min，15 min)后收集藻細胞，加入6 mL蒽酮試劑(立即搖勻)加完后在沸水浴80 ℃，15 min后取出流水冷卻，室溫靜置10 min，在625 nm處讀取其吸光度值。

1.9 活性氧自由基(ROS)和藻細胞膜通透性測定

ROS測定采用DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針法，使用南京建成生公司試劑盒(E004-1-1)進行測定。激發波長[(500±15)nm]，發射波長[(530±20)nm]。細胞通透性采用二乙酸熒光素(Fluorescein Diacetate，FDA)法測定[14]。使用全自動酶標儀(SENSE 425-301，芬蘭HIDEX公司)檢測。

1.10 普通小球藻對重金屬的吸附率

采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，PerkinElmer)測量吸附后暴露液中的Cr6+濃度及空白對照組Cr6+重金屬濃度，采用下列公式求出吸附率P[15]。

其中：C0為初始時暴露液中Cr6+濃度(mg/L)，Ct為吸附后暴露液中Cr6+濃度(mg/L)。

1.11 數據分析

數據以平均值±標準差(Mean±SD，n=3)表示，采用GraphPad Prism 8.0進行非線性曲線-最小二乘法回歸分析、普通單向方差分析和多重比較并作圖。處理組與對照組(CK)相比，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結果

2.1 不同濃度Cr6+對普通小球藻生物量的影響

不同濃度Cr6+對普通小球藻生長的影響如圖1所示，CK為空白對照組即0 mg/L處理組。隨暴露時間的延長和濃度的增加，抑制率逐漸增強。普通小球藻在96h時生長抑制最嚴重，0.1、0.75、1.5、2.25和3 mg/L濃度組抑制率分別達到了9.15%、28.03%、42.96%、53.10%、57.32%。通過非線性曲線-最小二乘法進行擬合得到擬合效應曲線，Cr6+對普通小球藻96 h-IC50為2.067 mg/L。

圖1 Cr6+對普通小球藻生長的影響及96 h抑制率曲線擬合Fig.1 Effects of Cr6+on the growth of C.vulgaris and 96 h in hibitionrate curve fitting

2.2 不同濃度Cr6+對普通小球藻葉綠素a含量的影響

由圖2可知，暴露96 h時隨著Cr6+濃度的增加葉綠素a受到的抑制作用也逐漸增強，0.1 mg/L濃度組葉綠素為0.95 mg/L，與對照組相比顯著下降了25.46%，其他各濃度組葉綠素分別為0.78、0.69、0.37和0.34 mg/L，與對照組相比分別下降了39.33%、45.75%、71.03%和73.40%。

圖2 Cr6+對普通小球藻葉綠素a含量的影響Fig.2 Effects of Cr6+on chlorophyll a content of C.vulgaris

2.3 不同濃度Cr6+對普通小球藻胞內多糖及蛋白質(TP)濃度的影響

隨著Cr6+脅迫濃度的升高，普通小球藻細胞中多糖和TP的濃度均呈下降趨勢。如圖3所示，0.1～1.5 mg/L處理組胞內多糖及TP濃度均無顯著性影響，但是2.25 mg/L和3 mg/L處理組多糖和TP的質量濃度與對照組相比均顯著下降，胞內多糖含量分別為0.219 mg/L和0.213 mg/L，降低了15.08%和17.28%；TP含量降低了60%和76.92%。

圖3 Cr6+對普通小球藻胞內多糖和蛋白含量的影響Fig.3 Effects of Cr6+ on intracellular polysaccharide and TP contents of C.vulgaris

2.4 不同濃度Cr6+對普通小球藻ROS和MDA含量的影響

由圖4可知，Cr6+脅迫誘導普通小球藻體內ROS的產生及積累且隨著脅迫的加強誘導作用增加。0.1～2.25 mg/L處理組與對照組相比，ROS無顯著性變化；3 mg/L濃度組ROS水平為對照組的6.0倍。并且MDA含量變化與ROS呈相同趨勢，3 mg/L處理組MDA含量為對照組的4.7倍。

圖4 Cr6+對普通小球藻ROS和MDA含量的影響Fig.4 Effects of Cr6+ on ROS and MDA contents of C.vulgaris

2.5 不同濃度Cr6+對普通小球藻膜通透性的影響

如圖5所示，不同濃度的Cr6+處理后，單個藻細胞通透性水平隨著Cr6+濃度的增加呈上升趨勢，0.1～1.5 mg/L與對照組相比無顯著差異，2.25和3 mg/L處理組通透性顯著增加，分別為對照組的1.77和1.79倍。

圖5 Cr6+對普通小球藻膜通透性的影響Fig. Effects of Cr6+ on membrane permeability of C.vulgaris

2.6 不同濃度Cr6+脅迫對普通小球藻抗氧化系統的影響

Cr6+脅迫處理96 h后，T-AOC、T-SOD、GSH和PCs活性變化如圖6所示。T-AOC和T-SOD活性除1.5 mg/L濃度組略微下降外，其他濃度組大體上均表現為上升的趨勢。T-AOC和T-SOD活性在0.1～2.25 mg/L處理組與對照組相比無顯著性差異，3 mg/L處理組差異顯著，分別為對照組的2.89倍和3.4倍。

圖6 Cr6+脅迫對普通小球藻T-AOC、T-SOD、PCs和GSH含量的影響Fig.6 Effects of Cr6+ on the contents of T-AOC，T-SOD，PCs and GSH in C.vulgaris

隨著脅迫濃度的升高，普通小球藻藻細胞內的GSH和PCs量均高于對照組。當2.25 mg/L暴露時，PCs含量顯著高于對照組，相較于對照組上升了4倍。在最高脅迫濃度3 mg/L時，PCs和GSH含量達到最大值，為對照組的6.37倍和2.35倍。

2.7 普通小球藻對不同濃度Cr6+吸附效率的影響

不同濃度Cr6+暴露96 h后對普通小球藻吸附效率的影響如表2和圖7所示，在不同濃度的Cr6+處理下藻細胞體內均富集了一定濃度的Cr6+。其中0.1 mg/L處理組暴露液Cr6+含量為(0.024±0.02)mg/L，Cr6+的吸附率最高，高達76.00%；3 mg/L處理組Cr6+的吸附率最低為21.40%。

圖7 普通小球藻對不同濃度Cr6+吸附率的影響Fig.7 Effects of different concentrations Cr6+ on the adsorption rate of C.vulgaris

表2 測定暴露液濃度Tab.2 The concentration of the exposed solution was determined

3 討論

3.1 不同濃度Cr6+對普通小球藻生長的影響

研究發現Cr6+對普通小球藻的生長表現出明顯的抑制作用，本實驗Cr6+對普通小球藻96 h-IC50為2.067 mg/L，魏群等[16]研究發現蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)在Cr6+濃度為5.66 mg/L時生長開始受到抑制；當Cr6+濃度大于2.08 mg/L時，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的藻密度才開始下降[17]。此次實驗中普通小球藻在Cr6+最低濃度0.1 mg/L時便受到抑制，并且與上述研究相比普通小球藻對Cr6+更為敏感，抑制了普通小球藻藻細胞的生長和葉綠素a的合成。在Cr6+毒性實驗的研究中，發現，Cr6+對水綿(Spirogyracommunis)生長及光合活性均有抑制作用，且高濃度抑制作用更明顯[18]。李印霞等[19]發現Cr6+質量濃度越大，銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)藻細胞數量明顯降低，葉綠素a也受到抑制，兩者均呈劑量-效應關系。本實驗中普通小球藻的生長與葉綠素的變化與前人研究結果一致。

3.2 不同濃度Cr6+對普通小球藻胞內多糖及蛋白質含量的影響

普通小球藻細胞含有豐富的藻多糖和TP。已有研究發現，小球藻多糖具有抗氧化和免疫抗病毒[20]等功能。低濃度組小球藻多糖相比對照組無顯著性差異，但隨著Cr6+濃度的增加，2.25 mg/L和3 mg/L濃度組多糖含量均顯著降低，此現象與葸玉琴等[21]研究一致。另外郭宏實等[22]在研究銅(Cu)脅迫杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)時也發現Cu會抑制光合色素、蛋白和多糖的合成。表明藻細胞在受到脅迫時細胞結構和功能遭到破壞，使得內容物外流影響了多糖的合成，所以導致多糖含量明顯降低。

普通小球藻細胞具有豐富的TP，受到脅迫時機體受損傷嚴重，藻細胞生長受抑制，細胞內活性物質減少，TP合成途徑受到影響。其TP含量與可溶性多糖含量趨勢呈一致性，均是2.25 mg/L和3 mg/L濃度組與對照組相比差異顯著。孫正等[23]發現隨著Cr6+濃度的增加杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)密度、光合色素和TP含量持續降低。這與本實驗結果基本一致。

3.3 不同濃度Cr6+對普通小球藻ROS、MDA含量和細胞膜通透性的影響

活性氧(ROS)作為信號分子是植物正常生長的代謝產物，也是有氧代謝的有毒副產物[24]，其含量的不正常增加意味著機體抗氧化水平已被打破。通過本實驗發現Cr6+誘導藻細胞體內ROS的產生及積累，低濃度組與對照組相比無顯著性差異，表明細胞受到刺激后，自身能夠激活一些抗氧化酶來清除一部分活性氧自由基；3 mg/L濃度組ROS水平為對照組的6倍，表明此時藻細胞自身合成的抗氧化酶達上限后無法完全清除全部的ROS，導致氧化損傷加劇。WEI等[25]發現Cr6+誘導萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)時光合活性降低，ROS和MDA含量顯著增加。還有在研究汞(Hg)的毒性實驗中，汞暴露也引起ROS的產生，從而導致藻細胞的減少[26]。

MDA含量的多少表示膜脂過氧化和膜受損傷的程度[27]，本實驗中MDA含量和細胞膜通透性呈上升趨勢，最高濃度組3 mg/L MDA含量為對照組的4.7倍，2.25 mg/L和3 mg/L處理組通透性分別為對照組的1.77和1.79倍。在逆境脅迫下，藻細胞內氧自由基含量增加導致膜脂過氧化進而阻礙藻細胞膜的合成[28]，使膜的流動性降低，通透性增大進而抑制生長。楊國遠等[29]研究表示，斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)在Cr6+的脅迫下MDA含量均高于對照組，T-AOC和T-SOD活性升高，與本實驗結果呈一致性。

3.4 不同濃度Cr6+對普通小球藻抗氧化能力的影響

重金屬脅迫誘導機體產生大量的ROS，藻細胞通過提高多種抗氧化酶活性減輕氧化損傷保護機體。T-AOC是由抗氧化物質和抗氧化酶組成的機體總抗氧化水平，決定著機體清除氧自由基的能力強弱。在本實驗中，Cr6+脅迫使得藻細胞T-AOC和T-SOD活性升高，和MDA含量的變化相似，在高濃度組3 mg/L與對照組相比差異顯著，結果表明受脅迫時最高濃度組與其他組相比產生了更多的ROS，導致了機體更顯著的氧化應激。Zn2+處理下米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)的T-AOC、SOD和MDA含量均高于對照組[30]。鄧祥元等[31]研究Hg脅迫蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)時，抑制了藻細胞生長和可溶性糖的合成，ROS、MDA和SOD活力顯著增加。綜合分析得出，藻細胞能及時調節抗氧化酶的活性來維持機體抗氧化系統的平衡，減少損傷。

3.5 不同濃度Cr6+對普通小球藻GSH和PCs含量的影響

在應對重金屬脅迫時還會在細胞內合成巰基化合物和抗氧化酶共同抵御毒害，其中GSH和PCs為主要螯合肽，其濃度的大小決定了解毒作用的強弱。PCs是以GSH為底物的在植物螯合肽合成酶(PCS)的催化下合成的產物[32]。本研究發現Cr6+脅迫誘導PCs大量合成的同時，也刺激了普通小球藻體內GSH含量的增加，在3 mg/L濃度組高達72.32 μmol/gprot，與對照組相比差異顯著。表明在Cr6+脅迫下，普通小球藻合成大量巰基化合物來螯合重金屬，降低對機體的損害，從而提高普通小球藻對Cr6+的自我修復和調節能力。并且在整個脅迫期間，GSH的含量增長幅度較緩，這可能是GSH既是細胞內的抗氧化劑又是PCs合成的底物的原因。劉媛等[33]研究在Cd脅迫下植物的葉片和根系中的巰基肽總量均顯著高于對照組，這與本實驗結果一致。

3.6 不同濃度Cr6+對普通小球藻吸附率的影響

已有研究表明藻類具有高金屬結合能力，藻細胞表面含有化學基團如羧基、羥基、氨基和硫酸鹽作為金屬的結合位點[34]。通過實驗研究發現普通小球藻對Cr6+有一定的吸附效果，可用于工業廢水的處理。0.1 mg/L處理組吸附率最高，推測是因為藻細胞處于對數生長期時，藻細胞增殖產生新細胞使得大量基團對重金屬離子進行物理吸附，因而吸附率達76%；而在高濃度Cr6+環境條件下，普通小球藻細胞膜受損傷嚴重，TP和多糖含量降低，用來和重金屬結合的化學基團受到影響，進而影響藻細胞對Cr6+的吸附，導致吸附率下降。這種情況與劉冬梅等[15]研究結果一致。

4 結論

本實驗結果表明普通小球藻在重金屬Cr6+的脅迫下，0.1 mg/L時藻細胞生長便會受到抑制。隨著重金屬離子濃度的增加，藻細胞生物量、Chl-a含量、TP和胞內多糖含量下降；ROS和MDA含量上升，膜脂過氧化導致細胞膜通透性的增強。為應對重金屬脅迫造成的氧化應激，T-AOC、T-SOD、GSH和PCs以活性升高的方式來抵御重金屬離子的毒害，但超過一定范圍其耐受性就會減弱。另外研究表明普通小球藻能夠富集一定的重金屬離子，這為普通小球藻應用于工業化污水處理提供一定的理論參考。

但是在自然水體生態環境中污染物并不是單一存在的，而是會與其他污染物相結合產生復合污染。因此，還需進一步深入研究重金屬和其他污染物復合對水生生物的毒性效應和耐受性，為水環境污染生態毒理提供科學依據。