UTMD 聯合抑制CREB基因促進動脈粥樣硬化斑塊穩定性的實驗研究

邱勤，徐萍，劉旭東

隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變，各種心肌梗死和缺血性腦卒中等致死性疾病正在逐漸年輕化且發病率顯著上升[1]。動脈粥樣硬化（AS）易損斑塊的破裂與心腦血管疾病的發生密切相關[2]。研究發現，炎癥因子、基質金屬蛋白酶（MMPs）和血管內皮生長因子（VEGF）在斑塊的形成和促進不穩定性中起著重要的作用；因此，抑制上述因子是增加斑塊穩定性的重要方法[3]。環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）是細胞內第二信使的轉錄因子，參與炎癥因子、斑塊內新生血管和MMP 的調節[4-7]，調節CREB的表達有望成為穩定斑塊治療AS的新方法。超聲靶向微泡破壞技術（UTMD）是一種新型的基因轉染方法，具有安全、無創、靶向性和可重復使用性好等優點，已廣泛應用于基因和藥物的靶向治療[8]。本研究將UTMD 與RNA 干擾技術相結合，構建針對CREB 的shRNA，以超聲微泡為載體釋放shRNA后用超聲輻照兔頸動脈斑塊組織，觀察其是否能通過抑制頸動脈斑塊中白介素（IL）-17A、MMP-2、MMP-9 和VEGF的表達，達到減促進斑塊穩定性的目的，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 健康雄性新西蘭兔（4～5月齡）20 只購自寧波大學動物實驗中心，體質量2.0 ～2.5 kg。完全隨機分為空白組（n=5），模型組（n=5），對照組（單純CREB 質粒組，n=5）和治療組（UTMD 聯合CREB 質粒組，n=5）。用液氮損傷右側頸總動脈（RCCA）后，采用含10%膽固醇的高膽固醇血癥飲食喂養10 周建立AS 模型，食物攝入量限制在100 g/d。本研究中的新西蘭兔于寧波大學實驗動物研究中心飼養，動物實驗按照寧波大學《動物實驗規定》進行。研究結束后，通過耳緣靜脈（150 mg/kg）注射戊巴比妥鈉對實驗動物實施安樂死。本研究經寧波大學實驗動物倫理委員會審批通過（申請編號：12698）。

1.2 超聲儀器及方法 彩色多普勒超聲診斷儀選用西門子Accuson S2000 超聲診斷儀，探頭頻率為6 ～18 MHz，用于斑塊的二維測量；麥瑞Resona7S 超聲診斷儀，探頭頻率為5 ～14 MHz，用于斑塊的彈性成像和造影；融海低功率聚焦超聲實驗裝置用于超聲輻照。分別在第0、56 和70 天對仰臥位兔子的右側頸總動脈進行了B-型超聲、實時剪切波彈性成像（SWE）和超聲造影檢查，評估斑塊的形狀、大小、回聲、硬度、微血管密度和頸總動脈內膜-中層厚度（CIMT）。同時治療組給予超聲輻照（輸出頻率650 kHz、輸出能量2.5 W/cm2、輻照時間3 min）。

1.3 超聲微泡和質粒轉染 GV102 質粒（6.4 kb）購自吉凱基因（中國上海），將質粒轉化為大腸桿菌TOP10 感受態細胞（吉凱基因，中國上海），并根據質粒提取試劑盒（中國北京天根）說明書提取純化。通過分光光度法（1 mg/ml）測量所得質粒DNA 的濃度，并在260 nm處測量質粒DNA的吸光度。OD260/OD280 在1.8 ～2.0 之間表明質粒DNA 中沒有污染，然后將產物保存于-20 ℃。聲諾維購自Bracco Imaging（意大利米蘭）。用0.9%氯化鈉注射液制備聲諾維微泡懸浮液，然后倒置或振動使微泡以（2 ～5）×108/ml 的密度和5 mg/ml 的濃度均勻分布。實驗前，將5 ml 聲諾維與1 ml 質粒DNA 溶液（含1 mg質粒）混合，在4 ℃下保存15 min 后，通過耳靜脈將混合物注射入AS 模型兔，然后對AS 模型兔右側頸動脈斑塊處進行3 min的超聲脈沖輻照（2.5 W/cm2）。

1.4 血脂測定 新西蘭兔禁食24 h后，通過耳緣靜脈抽取血液樣本后放入普通干燥試管中。采用自動生化分析儀分別測定第0 和56 天的血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.5 血清超敏C反應蛋白（hs-CRP）和IL-17A測定分別于第56 和70 天抽取3 ml 新西蘭兔空腹靜脈血，放入普通干燥試管中，立即行乳膠增強免疫比濁測定，測量血清hs-CRP 和IL-17A 水平。

1.6 蛋白質印跡分析 獲得組織提取物并在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質，轉移到PVDF膜上。用5% BSA 封閉后，將膜與適當稀釋的特異性一抗[抗CREB 抗體，抗VEGF，抗MMP-9，抗MMP-2 和GAPDH（購自上海愛必信）]在4 ℃下共孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗（博斯特，中國武漢）一起孵育后，使用增強型化學發光試劑可視化蛋白質條帶。

1.7 逆轉錄和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析使用Trizol 試劑從新西蘭兔右側頸總動脈中提取總RNA，使用分光光度法測量總RNA 量，并使用逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA。RNA 定量是通過qRT-PCR 進行的，引物如下：-actin（正義鏈：5’-ATCAGCAAGCAGGAGTAT-3’，反義鏈：5’-CAATCTCGTCTCGTTTCTG-3’），兔CREB（正義鏈：5’-TCAGCTCCTCAATCAGCGTCT-3’，反義鏈：5’-AGTTGTTATGGCTTCCTCCCC-3’），兔MMP-9（正義鏈：5’-CCACCACAACATCACGTACTGGA-3’，反義鏈：5’-ACTGGATGACAATGTCTGCGTCC-3’），兔MMP-2（正義鏈：5’-CTTCGTGTAGGTGTAAATGGG- 3’，反義鏈：5’-TTCCTGGGCAACAAGTATGAG-3’）和兔VEGF（正義鏈：5’-GGTGACGTTGAACTCCTCGGT-3’，反義鏈：5’-GGAGACAATAAACCCCACGAA-3’）。qRT-PCR 數據的分析通過比較2- CT方法進行。

1.8 組織學和免疫組織化學 切除新西蘭兔右側頸總動脈的組織塊，在4%多聚甲醛中固定48 h，嵌入石蠟中，切片用蘇木精/伊紅（HE）染色。使用的一抗為抗CREB 抗體、抗MMP-9、抗MMP-2 和抗-VEGFR 抗體，按1∶500 稀釋。二抗為辣根過氧化物酶-山羊抗-兔IgG。二氨基聯苯胺用于產生信號。切片用蘇木精輕輕復染。

1.9 統計方法 實驗數據通過Graphpad Prism 6.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較用獨立樣本t 檢驗和Menn-Whitney 檢驗，多組比較用單因素方差分析和Kruskal-Wallis檢驗，多重比較用LSD-t 和Dunnet t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立AS動物模型 喂養10 周后，模型組體質量高于空白組（t=12.34，P ＜0.05），見圖1a。模型組TC、HDL-C 和LDL-C 顯著增加，特別是血清TC 和LDL-C 濃度與空白組相比分別上調了15 和12 倍，見圖1b。模型組RCCA 中可觀擦到斑塊回聲形成（圖1c），同時，與空白組相比，模型組的頸動脈內中膜厚度（CMIT）顯著增加（t=10.19，P ＜0.05），見圖1d，證明AS 動物模型建立成功。

2.2 4組新西蘭兔CREB mRNA 水平比較 4組CREB mRNA水平差異有統計學意義（F=14.15，P＜0.05）。其中治療組CREB mRNA 水平和表達顯著低于模型組和對照組（t=4.88、7.50，均P ＜0.05）；模型組和對照組的CREB mRNA 水平和表達均較高，但兩組間差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖2。

圖2 qRT-PCR 和Western blot 評估轉染效率

2.3 4組新西蘭兔hs-CRP、IL-17A 水平比較 4組hs-CRP、IL-17A 水平差異有統計學意義（F=107.30、73.81，均P ＜0.05）。其中模型組hs-CRP 和IL-17A水平高于其他組（t≥13.51，均P ＜0.05）；治療組hs-CRP 和IL-17A 水平低于對照組（t=2.50、7.18，均P ＜0.05），見圖3。

圖3 4組血清hs-CRP 和IL-17A 水平比較

2.4 4組新西蘭兔VEGF、超聲造影峰值強度和楊氏模量值水平比較 4組VEGF mRNA 差異有統計學意義（F=213.61，P ＜0.05），其中模型組VEGF mRNA 水平高于其他組（t≥13.10，均P ＜0.05）；治療組VEGF mRNA 水平低于對照組（t=28.50，P ＜0.05），見圖4a、b。治療組斑塊組織的楊氏模量值明顯高于其他兩組（t=7.96、4.60，均P＜0.05），見圖4c、d；而治療組斑塊的超聲造影峰值強度低于模型組和對照組（t=8.54、5.54，均P ＜0.05），見圖4e、f。治療組VEGF 表達陽性細胞數明顯低于模型組和對照組，見圖4g。

2.5 4組新西蘭兔MMP-2、MMP-9 水平比較 4組MMP-2 和MMP-9 的mRNA 水平差異有統計學意義（F=93.78、41.66，均P ＜0.05），其中模型組MMP-2 和MMP-9 的mRNA 水平高于其他組（t≥6.72，均P ＜0.05），治療組MMP-2 和MMP-9的mRNA 水平低于對照組（t=4.95、4.59，均P ＜0.05），見圖5a ～d。與模型組和對照組相比，定位于細胞質中的MMP-2 和MMP-9 在治療組中的表達顯著降低，見圖5e、f。

3 討論

AS 不穩定斑塊的形成與以下三個方面密切相關：（1）炎癥。炎癥是引起斑塊不穩定的關鍵因素，斑塊破裂及糜爛幾乎與炎癥共存，在斑塊的不穩定狀態時炎癥總是上調的[9-11]。（2）MMP。斑塊纖維帽的主要成分是細胞外基質，MMP是降解細胞外基質最重要的酶類；不穩定斑塊的MMP 活性增加，纖維帽強度減弱，斑塊變得易破裂[12-14]。（3）新生血管。活化的巨噬細胞可產生VEGF，導致內膜新生血管的形成；新生血管主要分布在斑塊的肩部和基底部，成為炎性細胞和脂質成分進入斑塊的通路；此外，新生血管發育不完善基底膜不完整，故易于破裂和出血，導致斑塊的不穩定[15]。因此尋找能抑制以上三方面的靶點并進行干預來促進斑塊的穩定性是本實驗的研究基礎。

CREB是細胞中第二信使的轉錄因子。Westbom等[16]發現CREB 可以上調炎癥因子，參與體內的炎癥過程。有研究報道，CREB 可參與某些病理生理過程中MMP 的調節[17]。還有研究發現CREB 與VEGF 的表達密切相關[4]。這提示CREB 可通過調控炎癥因子、MMP和VEGF的表達促進斑塊的不穩定性。本研究通過建立新西蘭兔AS 斑塊模型并在此基礎上進行了CREB-shRNA 質粒的轉染。結果發現，CREB-shRNA 質粒可沉默AS 斑塊模型血清中炎癥因子hs-CRP 和IL-17A 表達；同時AS 斑塊中MMP-2、MMP-9 及VEGF 的表達也隨之下調；超聲彈性成像顯示斑塊的楊氏模量值上升，超聲造影顯示斑塊的造影峰值強度下降。這證實了CREB 對斑塊不穩定性的促進作用，沉默CREB 可增加斑塊的穩定性。

UTMD治療性超聲已顯示出其作為靶向破壞腫瘤脈管系統的巨大潛力。研究較多且具有潛力的策略是用治療劑加載微泡，在超聲治療區域內靶向破壞微泡時能夠局部釋放有效載荷。該技術正在探索用于局部基因轉染、靶向藥物遞送和釋放、血腦屏障破壞和溶栓等方面。本研究微泡與CREB 質粒結合作為靶向治療的是一種具有潛力且可行性高的新方法。

綜上所述，用UTMD 遞送和靶向CREB 質粒釋放比單純的CREB 質粒轉染可以更有效地沉默CREB 基因，更能有效降低CREB、VEGF、MMP-2、MMP-9 和炎癥因子hs-CRP、IL-17A的表達，且擁有更高的楊氏模量值和更低的超聲造影峰值強度，達到穩定斑塊的目的。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 邱勤：論文撰寫、統計學分析、數據整理；劉旭東：實驗操作、數據整理；徐萍：研究指導、論文修改、經費支持