Loop B3對GH7內切纖維素酶功能的影響機制

楊俊釗 張新蕊 孫清揚 鄭菲

（北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

糖苷水解酶第七家族纖維素酶（glycoside Hydrolases family 7, GH7）在天然生物質轉化和降解中具有重要作用，因此一直是許多研究的熱點。在GH7中，主要包含外切纖維素酶和內切纖維素酶兩大類，其中，內切纖維素酶全部來自真菌，作用于纖維素內部的非結晶區，隨機水解分子內部的β-1,4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子切割成短鏈［1］；外切纖維素酶作用于纖維素鏈的還原/非還原性末端，將短鏈的纖維素分子切成纖維二糖［2］。目前，對GH7的研究主要集中在外切纖維素酶方面，而對內切纖維素酶的關注相對較少。CAZymes數據庫（carbohydrate?active enzymes, CAZymes）已被收錄的具有性質報道的GH7內切纖維素酶僅有27個，大多在50-60℃和pH 4.0-5.0顯示出最大酶活力［3-6］。根據PDB數據庫（protein data bank, PDB）中收錄的5個GH7內切纖維素酶晶體結構［ThCel7B（Trichoderma harzianum CBS 226.95, PDB ID: 5W0A）、TrCel7B（Trichoderma reesei, PDB ID :1EG1）、ReCel7B（Rasamsonia emersonii CBS 394.64, PDB ID: 6SU8）、FoCel7B（Fusarium oxysporum, PDB ID:1OVW）和HiCel7B（Humicola insolens, PDB ID:6YOZ）］［7-11］可知，GH7內切纖維素酶的催化結構域是由6個loop區（A1、A2、A3、B1、B3和B4）圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結構［12］。GH7內切纖維素酶中共有9個底物結合位點（?7 -+2）［13］。其中，loop A1和B1位于底物結合位點?7- ?4處，loop A3和B3位于催化活性中心附近，loop B4位于產物出口處［11］。由于覆蓋在催化口袋的loop較短，尤其是loop A3和loop B3的長度不能夠完全包裹催化中心，使得活性中心更加暴露。

研究表明，催化口袋周圍的loop參與酶的催化、底物結合過程，同時對酶的熱穩定性也起著重要作用［14］。例如，GH12內切纖維素酶NfEG12A具有較長的loop 3結構，通過改變loop結構的長度，加強了底物和酶之間的氫鍵相互作用，從而提高了產物分子的轉化率［15］。將GH5纖維素酶GtCel5 loop 6上的天冬酰胺Asn進行飽和突變后，篩選到N233G突變體的比活值及催化效率較野生型顯著提高［16］。此外，loop結構對酶的熱穩定性也起到重要作用，有研究人員將幾丁質酶BcChi?A的loop?III截斷后，其Tm值下降10℃［17］。GH7外切酶與內切酶的loop區具有類似的結構，在GH7外切纖維素酶中，loop結構參與酶的催化過程。研究人員將TrCel7A與纖維四糖、纖維戊糖和纖維己糖的復合物分別共結晶，觀察到3個復合物結構中的loop B3區均參與底物的結合過程，且在催化過程中顯示出較高的柔性［18］。研究人員通過截斷TrCel7A loop B3中的8個殘基（245GTYSDNRY252），驗證得出酶對結晶纖維素的活性降低了50%，這表明loop B3是GH7酶催化的一個重要組成部分［19］。盡管有部分研究的關注點在GH7外切酶的loop區上，但對于內切纖維素酶loop區的功能仍缺乏相關研究。經分析，在GH7內切纖維素酶loop區中，loop B3位于催化中心附近［11］，其氨基酸序列長度可分為兩種類型：一類是包含18個氨基酸殘基的長鏈型；另一類是包含4個氨基酸的短鏈型。據研究顯示，大多數耐熱性能比較好的GH7內切纖維素酶均包含短鏈型的loop B3結構［3-5,11］。為了探究loop B3在GH7內切纖維素酶中的影響效果及其機制，本文以嗜熱毀絲菌M.thermophila來源的GH7纖維素酶MtCel7b為核心研究材料，通過截短其長鏈loop B3中的14個氨基酸殘基（216GPYLCEGAECEFDG229），構建B3cut突變體，并分析比較突變體與野生型之間在酶催化效率及熱穩定性方面的差異，為GH7內切纖維素酶loop區的功能研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因和載體 Mtcel7b 基因編碼序列由北京睿博興科生物技術有限公司合成；克隆宿主大腸桿菌感受態細胞Escherichia coli Trans1?T1購自北京全式金生物技術有限公司，用于目的基因的克隆。表達質粒pPIC9和表達宿主畢赤酵母Pichia pastoris GS115購自美國Invitrogen生命技術有限公司，用于表達載體的構建和外源基因的表達。

1.1.2 主要試劑與儀器 無縫克隆與重組試劑盒、快速凝膠提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉購自賽默飛世爾科技公司；底物羧甲基纖維素鈉（CMC?Na）、地衣多糖、大麥葡聚糖購自Sigma?Aldrich。瓊脂糖購自Biowest公司、YNB購自北京蘭博利德生物技術有限公司。D?無水葡萄糖和瓊脂粉均購自博奧拓科技有限公司。

PCR儀，Bio?Rad T100型梯度PCR儀分子擴增儀；蛋白電泳儀，DYY?8C電腦三恒多用電泳儀；培養箱，一恒Blue pard經濟型生化培養箱；分子過濾膜包，賽多利斯回旋流切向流超濾器超濾膜包VF20P4；酶標儀，瑞士Tecan M200 PRO多功能酶標儀；蛋白純化儀，?KTA Pure；核酸蛋白測定儀，賽默飛NanoDrop2000超微量分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 序列與結構分析 使用ExPASy?ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白的理論分子量和等電點進行分析，使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/servi Ces/Signa LP/）對蛋白的信號肽進行預測，利用BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool protein）對蛋白序列進行同源性分析，利用Smart（http://smart.embl?heidelberg.de/）對蛋白質的結構域進行預測，利用AlphaFold2對蛋白質建模。

1.2.2 質粒構建與提取 將目的基因Mtcel7b重組至pPIC9表達質粒EcoR I/Not I克隆位點處，利用熱激法轉化至Escherichia coli Trans1?T1細胞中，后涂布于固體LB培養基［0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化鈉（W/V），1.5%瓊脂粉（W/V）］上，37℃倒置培養。12 h后挑取單克隆進行菌落PCR驗證并送測序，后將測序正確的克隆子接入到液體LB培養基［0.5%酵母浸粉（W/V），1%胰蛋白胨（W/V），1%氯化鈉（W/V）］中，在37℃條件下培養12 h，然后提取質粒。突變體B3cut的構建是以Mtcel7b為模板，以MtCel7b?F1′（5′?GA GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC?3′），MtCel7b?R1′（5′?AGGCGAATTAATTCGCGGCCGC?3′）；B3cut?F2′（5′?CTCATCCTTGTTCCAAGGCTGTATGTGATAAGAA TGGTTGCGCCTG?3′），B3cut?R2′（5′?CAACCATTCTTA TCACATACAGCCTTGGAACAAGGATGAGGAG?3′）為兩組特異性引物進行PCR擴增，利用overlap PCR方法獲得突變體基因的全長。PCR反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃終延伸5 min；4℃保存。質粒提取方法同Mtcel7b。

1.2.3 蛋白的表達與純化 重組質粒pPIC9?Mtcel7b用限制性內切酶Dra I線性化處理，經核酸電泳純化后回收線性化產物，通過電擊轉化至畢赤酵母GS115感受態細胞，然后涂布在固體MD培養基［1.5%瓊脂糖（W/V），2%葡萄糖（W/V），滅菌后加入1.34% YNB（W/V），4×10-4生物素（W/V）］上。在30℃倒置培養48 h后，篩選出重組轉化子。用牙簽隨機挑選48個克隆子，在固體MD平板上點種，并在30℃恒溫箱內倒置培養48 h。同時，將牙簽挑取的克隆子接種于含有3 mL BMGY培養基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），1%甘油（W/V），滅菌后加入1.34% YNB，4×10-4生物素（W/V）］的酵母管中。在30℃，200 r/min培養48 h后離心去除上清液，菌體用1 mL BMMY培養基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），滅菌后加入1.34% YNB，4×10-4生物素，0.5%甲醇（V/V）］重懸，誘導培養48 h后離心收集上清液。利用3,5?二硝基水楊酸（DNS）法測定酶活，并用SDS?PAGE檢測是否表達出目的蛋白。將篩選出的高活性陽性克隆子接種至30 mL YPD液體培養基［1%酵母浸粉（W/V），2%胰蛋白胨（W/V），2%葡萄糖（W/V）］中，30℃，200 r/min培養48 h后，以 0.5%（V/V）的接種量接種至BMGY液體培養基中。30℃，200 r/min培養48 h后，收集菌體轉移至BMMY誘導培養基中，30℃，200 r/min繼續誘導培養48 h，每隔24 h補加一次甲醇［0.5%（V/V）］。48 h后收集上清液，利用10 kD膜包濃縮至15 mL體積后進行脫鹽處理，脫鹽處理后的酶液加入到平衡后的HiTrap QXL陰離子交換層析柱中，在10 mmol/L的pH 8.0的Tris?HCl緩沖液中，使用0-1 mol/L NaCl進行線性梯度洗脫，收集相應的峰所對應的蛋白并進行酶活性的測定和SDS?PAGE分析。

1.2.4 酶活力的測定 纖維素酶的酶活性測定采用DNS法，具體反應體系為50 μL適當稀釋的酶液加入到450 μL底物中，恒溫中反應10 min，后加入750 μL DNS 終止反應，沸水煮5 min后立即置于冷水中冷卻至室溫。從反應體系中吸取250 μL在540 nm下測定吸光值，根據標準曲線計算出相應酶活值，每組實驗設置3個重復。酶活定義為：在酶的最適條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量為1個單位（U）。

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1.2.5 酶學性質分析

1.2.5.1 最適溫度和溫度穩定性的測定 將純化后的酶進行適當稀釋，選擇10 mg/mL CMC?Na作為底物，溫度范圍設定為40-70℃，重組酶在最適pH條件下反應10 min，測定酶活。將最高酶活性設置為100%，并計算其他溫度下的活性作為相對值（%），并繪制最佳溫度趨勢圖。將重組酶分別在70、80和90℃下分別孵育2、5、10、30和60 min后，在最適條件下測定酶活力。以未處理酶液的酶活值作為100%，計算各時間點和溫度點下的相對酶活值并繪制溫度穩定性趨勢圖。

1.2.5.2 最適pH及pH穩定性的測定 重組酶和底物（10 mg/mL CMC?Na）分別用不同pH緩沖液（pH 3.0-7.0：100 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉；pH 8.0-9.0：100 mmol/L Tris?鹽酸；pH 10.0-12.0：100 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉）進行稀釋，將重組酶放置在最適溫度條件下反應10 min，測定各pH條件下的剩余酶活。以酶活最高的pH條件下的酶活值作為100%繪制最適pH和pH穩定性趨勢圖。

1.2.5.3 比活值測定 以450 μL的10 mg/mL CMC?Na、10 mg/mL大麥葡聚糖、10 mg/mL地衣多糖為底物，分別向其中加入50 μL適當稀釋的酶液，在重組酶最適條件下反應10 min，測定重組酶的比活值。

1.2.5.4 動力學常數的測定 以濃度范圍為4-20 mg/mL的CMC?Na為底物，反應體系包含450 μL的底物和50 μL的酶液，在最適條件下反應5 min，測定酶活性。利用雙倒數法作圖并計算得到Km、Vmax、kcat及kcat/Km的值。

1.2.5.5 耐鹽性和鹽穩定性的測定 重組酶耐鹽性的測定是將CMC?Na溶于不同濃度的NaCl（1-4 mol/L）溶液中，在最適條件下，與適當稀釋的酶液孵育10 min，測定剩余酶活力。在測定酶的鹽穩定性時，將重組酶與不同濃度的NaCl（1-5 mol/L）混合后在37℃下共同孵育1 h，后取50 μL孵育后的酶液與450 μL CMC?Na在最適條件下反應10 min。以酶活最高的鹽濃度條件下的比活值為100%繪制耐鹽性和鹽穩定性趨勢圖。

2 結果

2.1 序列與結構分析

來源于M. thermophila的GH7內切纖維素酶編碼基因Mtcel7b（GenBank Accession No.：XP_003664606.1）核苷酸序列全長為1 368 bp，編碼456個氨基酸，前20個氨基酸為信號肽序列，其去除信號肽后的理論分子量為47.2 kD，等電點為4.75。MtCel7b的結構預測模型表明（圖1?A），MtCel7b的結構與其他GH7家族纖維素酶一樣，由6個loop區圍繞反向平行的β-折疊形成的β-三明治結構。多序列比對結果（圖1?B）顯示，E194、D196、E199為催化三聯體，其中，E194和E199分別作為親核試劑和酸/堿試劑催化糖苷鍵斷裂（編號不包括信號肽序列）。MtCel7b的loop B3比其他短鏈的內切纖維素酶多出14個氨基酸殘基。MtCel7b長鏈的loop B3額外形成了一個β-折疊片和一個α-螺旋結構。

圖1 MtCel7b結構模擬（A）及氨基酸序列對比（B）Fig. 1 Structural simulation（A）and amino acid sequence alignment（B）of MtCel7b

2.2 MtCel7b及其突變體的表達和純化

SDS?PAGE結果顯示（圖2），野生型MtCel7b與突變體B3cut的表觀分子量均大于其理論分子量（MtCel7b: 47.2 kD；B3cut: 45.7 kD）。經預測，野生型與突變體均包含3個N糖基化位點，可能是造成表觀分子量大于理論分子量的原因之一。

圖2 野生型MtCel7b和突變體B3cut的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3 MtCel7b及其突變體的酶學性質分析

2.3.1 最適溫度及溫度穩定性分析 在pH 5.0條件下測定野生型及突變體在不同溫度（40-70℃）下的酶活力，由圖3?A可知，MtCel7b的最適溫度為60℃，在40-60℃之間的酶活力均在80%以上。將MtCel7b分別在70、80和90℃下孵育，檢測其剩余酶活力（圖3?D-F）。結果表明，MtCel7b具有良好的耐熱性，在80℃和90℃條件下處理5 min后，剩余酶活仍保持在80%以上（圖3?E, F）。此外，MtCel7b在90℃孵育1 h后仍可檢測到40%以上的酶活性。突變體B3cut的最適溫度為50℃，整體趨勢較野生型變窄（圖3?A）。突變體在70、80和90℃的熱穩定性較野生型提高，尤其在90℃孵育1 h后，其剩余酶活高達56%（圖3?F）。

圖3 野生型MtCel7b及突變體B3cut的酶學性質Fig. 3 Enzymatic properties of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3.2 最適pH及pH穩定性分析 在pH 3.0-9.0范圍內測定最適pH值（圖3?B）。MtCel7b的最適pH為5.0，在pH 5.0-6.0范圍內保留大約80%以上的酶活性。B3cut與野生型一致均在pH 5.0下表現出最佳酶活性，但突變體的pH耐受范圍縮小（圖3?B）。在pH 4.0時，野生型的相對酶活性高達79%，而突變體的相對酶活性為40%。此外，MtCel7b和突變體B3cut在pH 4.0-12.0穩定性較好，在37℃下處理1 h后，仍然具有90%以上的酶活（圖3?C）。

2.3.3 耐鹽性和鹽穩定性分析 在0-4 mol/L和0-5 mol/L NaCl中，測定了耐鹽性和鹽穩定性。在耐鹽性方面，MtCel7b的相對比活隨著底物中鹽濃度的增加而逐漸降低（圖4?A），即當2 mol/L時，MtCel7b的相對比活值為55%，而當底物中鹽濃度增加至4 mol/L時，MtCel7b的相對比活值下降至37%。鹽穩定性檢測中，當酶液分別與0-5 mol/L NaCl緩沖液孵育1 h后，其野生型的比活值保持恒定，具有穩定的耐鹽性（圖4?B）。進一步分析顯示，雖然突變體B3cut經過0-5 mol/L NaCl溶液分別處理后的活性變化趨勢與野生型一致，但是其在不同濃度下的相對比活值明顯高于野生型，說明突變體B3cut在0-5 mol/L NaCl的濃度下穩定性更好。

圖4 野生型MtCel7b及突變體B3cut的耐鹽性（A）與鹽穩定性（B）Fig. 4 Halo tolerant（A）and halo stability（B）of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

2.3.4 比活性和動力學分析 以10 mg/mL CMC?Na、大麥葡聚糖和地衣多糖為底物測定MtCel7b及其突變體的比活性。MtCel7b水解CMC?Na、大麥葡聚糖和地衣多糖的比活值分別為（38 ± 2）、（790 ± 1）和（493 ± 10）U/mg（圖5）。突變體B3cut表現出與野生型相似的底物偏好，但B3cut水解這3種底物的比活值分別降低至（25 ± 1）、（255 ± 1）和（130± 3）mg/mL，較野生型降低了34%-74%。

圖5 野生型MtCel7b及突變體B3cut的比活值Fig. 5 Specific viabilities of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

以4-20 mg/mL CMC?Na作為底物，在最適反應條件下測定酶的動力學參數。MtCel7b的Km和Vmax值分別為（8.8 ± 0.8）mg/mL和（143± 7）μmol/（min·mg），kcat/Km為（12.8 ± 0.1）mL/（mg·s）。與野生型相比，突變體的Vmax［（69± 8）μmol/（min·mg）］較野生型降低52%，催化效率［（4.9 ± 0.6）mL/（mg·s）］比野生型低約62%，并且突變體對底物的親和力減弱［Km=（10.9± 3.3）mg/mL］。

2.4 分子動力學模擬分析

根據圖6的RMSD的結果來看，MtCel7b與突變體在50 ns后達到平衡，平均RMSD值均為2.0 ?。MtCel7b與突變體均在loop區域表現出相似的RMSF趨勢，波動越大，顯示出loop區的靈活性越強。突變體中與loop B3相鄰的257-266位殘基的RMSF值增加到5 ?，而野生型相應位置的RMSF值僅為2 ?（藍色虛線框）。說明截短loop B3后，會影響相鄰結構的波動情況。

圖6 野生型MtCel7b及突變體B3cut的均方根偏差和均方根波動圖Fig. 6 RMSD and RMSF of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

圖7?A, B的主成分分析圖說明野生型與突變體均具有5種不同的狀態，分別以不同顏色顯示。野生型的樣點分布分散，表明每種狀態之間的相似性較低，結構變化較大。但是，突變體狀態內與狀態之間的聚類情況良好，樣點分布更加集中，狀態間有較好的區分，說明其在100 ns分子動力學模擬過程中構象相對穩定。提取分子動力學模擬的平均結構用于進一步分析，根據預測蛋白活性口袋大小的在線網站POCASA（http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）計算得到野生型MtCel7b和突變體B3cut活性口袋的體積分別為2 799 ?3和1 078 ?3，野生型的口袋體積大概是突變體的2.5倍（圖7?C,D）。圖7?E, F顯示，B3cut的loop A3（351GDN353）和loop B1（W52）均向催化活性中心移動，導致其催化通道較野生型更加密閉。從平均結構看出，野生型的loop B3周圍有一個復雜的氫鍵相互作用網絡（圖7?E）。C225主鏈羧基O和主鏈氨基H分別與K233側鏈氨基HZ2和G222主鏈羰基O形成側鏈-主鏈氫鍵和主鏈氫鍵，并且C225還與C220的巰基形成二硫橋。在復雜的氫鍵網絡的控制下，K233側鏈氨基HZ3和主鏈氨基H分別與E226主鏈羰基O和C231主鏈羰基O形成側鏈 - 主鏈氫鍵和主鏈氫鍵。然而，由于loop B3截短，K233失去周圍氫鍵束縛，導致其側鏈扭轉了120°，并且側鏈氨基HZ2與催化殘基E194的側鏈羧基OE1形成鹽橋，并且K233的主鏈氨基H和D232側鏈羧基OD2形成新的側鏈-主鏈氫鍵，使兩個催化殘基（E194、E199）的Cα距離從12.7 ?減少到11.7 ?，并且明顯縮小了催化口袋。

圖7 野生型MtCel7b及突變體B3cut分子動力學模擬的軌跡主成分分析及平均結構圖Fig. 7 Trajectory principal component analysis plots and average structure of molecular dynamics simulations of wild-type MtCel7b and mutant B3cut

除此之外，催化通道兩端殘基的位置也發生了改變。圖7?C, D表明，突變體的催化口袋明顯較野生型窄。如圖所示，殘基W52、Q172、K233、N234、R242、G351、D352、N353、W356和E361均向催化中心移動。在催化通道的?3位處，突變體B3cut中的loop B1中W52側鏈的方向發生了變化，與野生型相比更接近催化中心。B3cut的loop A3中D352主鏈羰基O和靠近loop B3的Q172側鏈酰基2HE2之間形成側鏈-主鏈氫鍵，導致催化口袋被周圍的氨基酸覆蓋，催化通道的入口變窄。同時，在催化通道的+2位點處，氨基酸的取向也發生了變化，從而引起了氫鍵的改變。在野生型中，R242側鏈胍基2HH2和主鏈氨基H只與W356主鏈羰基O和N239側鏈酰基OD1之間形成側鏈-主鏈氫鍵（圖7?E），而在B3cut中，R242周圍形成了一個新的復雜的氫鍵網絡。如圖7?F所示，R242主鏈氨基H、側鏈胍基1HH1、2HH2、HE分別與催化裂隙上方的N239側鏈酰基OD1、A237主鏈羰基O和裂隙下方的E361側鏈羧基OE1、OE2之間形成側鏈-主鏈氫鍵，這使得催化通道正位處變窄。雖然R242沒有與W356形成氫鍵作用力，但W356的吲哚環旋轉了50°，使產物生成部位更加封閉，增加了催化裂隙的疏水性。

3 討論

MtCel7b的最適溫度和最適pH值與大多數真菌源的GH7內切葡聚糖酶相似，均在50-60℃和pH 4.0-5.0的范圍內顯示出最大的酶活性［3-6］。此外，與先前的報道一致，MtCel7b對大麥葡聚糖的比活值高于對CMC?Na的水解活性，這可能是由于CMC?Na的分子結構被甲氧基側鏈高度取代，從而干擾酶的活性［20］。目前報道的大多數GH7內切酶都屬于嗜中溫酶，例如，來源于Aspergillus oryzae KBN616的CelA和CelB分別在60℃和55℃的溫度處理10 min后迅速失活［3］，當在60℃條件下處理10 min后，來自H. grisea var. thermoidea的EGI穩定性瞬間下降［4］。來源于A. fumigatus的Af?EGL7在60℃的溫度下處理30 min基本失活［6］。相比之下，MtCel7b的耐熱性顯著優于其他已知的GH7內切纖維素酶，在90℃的溫度下處理1 h后仍能剩余40%以上的酶活，這大大提高了MtCel7b在工業應用上的潛力。除此之外，MtCel7b也表現出良好的耐鹽性。有研究表明，嗜鹽蛋白的標志之一是表面具有較高的負電位，蛋白質表面過量的酸性氨基酸殘基有助于增強水分子和金屬離子的結合，有助于形成水化膜，保護并維持蛋白質的結構完整性和活性［21-22］。在本研究中，MtCel7b蛋白表面具有大量負電荷殘基。其中，MtCel7b有64個帶負電荷的殘基，天冬氨酸占總氨基酸殘基的7.1%，谷氨酸占7.6%。B3cut有60個帶負電荷的殘基，天冬氨酸和谷氨酸均占總氨基酸殘基的7.1%。蛋白質表面大量的酸性殘基也使得酶具有較低的pI（pI MtCel7b= pIB3cut= 4.86）。纖維素酶作為工業應用的關鍵酶系，需要適應工業操作中特殊的物理和化學環境［23］。例如，在食品加工過程中，會遇到高溫（如烘焙、烘干等）、低溫（如低溫發酵、果汁澄清等）、高壓（如研磨、擠壓等）、高滲（如鹽漬、糖漬等）、強酸、強堿等較為苛刻的環境條件［24］。所以，能適應極端環境的酶備受工業青睞。MtCel7b在酶學性質上展現出的良好的耐熱、耐鹽性，表明其具有一定的潛在研究價值和工業應用價值。Loop區結構及氨基酸組成是影響酶熱穩定性及活性的一個主要因素，尤其是催化通道周圍的loop區［25］。本研究中，將MtCel7b loop B3截短后發現，突變體B3cut雖然活性降低了，但其在高溫下的熱穩定性較野生型有所提高。分子動力學模擬結果表明，loop B3的局部變化使酶的整體構象發生了較大程度的改變，特別是底物通道兩端，結構更加緊湊，從而在高溫環境下保持穩定。此外，loop B3的缺失也使催化通道內的氫鍵作用網絡重新排布，尤其是催化殘基周圍的區域。在突變體中，K233位點喪失了與loop B3之間的聯系，與催化殘基E194建立了新的鹽橋，導致兩個催化位點之間的空間距離改變，從而使突變體的活性顯著下降。Km值的增大也從另一個角度說明，突變體催化通道內氫鍵網絡的變化使酶結合底物的能力有所減弱。綜上所述，野生型loop B3中氨基酸之間的氫鍵相互作用網絡的影響使得MtCel7b具有更開放的催化裂隙，可以招募更多的底物分子，而突變體由于催化裂隙的開口變小，可能會干擾酶對底物的抓取和釋放，因此，突變體的催化效率較野生型顯著降低。本研究豐富了GH7嗜熱內切纖維素酶的酶資源庫，同時為纖維素酶loop結構的研究提供了理論支持。

4 結論

本研究從M. thermophila克隆表達了一個新型嗜熱、鹽耐受度高的GH7內切纖維素酶MtCel7b，通過構建loop B3截短突變體，探究了loop B3對GH7內切纖維素酶熱穩定性及催化活性的重要影響。酶學性質與分子動力學模擬結果顯示，MtCel7b中長鏈的loop B3可以增加催化活性通道的體積，使其在催化底物過程中更加靈活。截短loop B3后，導致突變體B3cut催化通道體積的減小，酶的催化效率降低，熱穩定性增強。