灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因克隆及功能研究

楊敏 龍雨青 曾娟 曾梅 周新茹 王玲 付學森 周日寶，2，3劉湘丹，2，3

（1. 湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2. 湘產大宗道地藥材種質資源及規范化種植重點研究室，長沙 410208；3 湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 410208）

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.?Mazz.為中藥材山銀花的主要來源品種之一［1］，主要以干燥花蕾或者初開的花入藥，具有疏散風熱、清熱解毒之功效，用于風熱感冒、癰腫疔瘡、溫病發熱、熱毒血痢等癥狀［2］。灰氈毛忍冬多被應用于醫藥、園藝、化妝品［3］等行業，還可以作為抗氧化劑的提取來源［4］，具有巨大的藥用、經濟及生態價值。

皂苷類為灰氈毛忍冬中重要化學成分之一，主要包括灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲［5］，現代藥理研究表明，該類成分具有保肝、抗癌、抗氧化、抗補體活性等作用［6-10］?；覛置潭碥諏儆邶R墩果烷型五環三萜類化合物，其生物合成途徑包括上游前體物質3?異戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成，中游氧化鯊烯環化酶（OSCs）催化的碳環骨架的合成，下游細胞色素P450酶（CYP450s）氧化和糖基化反應生成各種植物三萜皂苷［11-12］。糖基轉移酶（GTs）是能夠催化糖基化反應的一大類酶，在生物體內以超基因家族的形式存在，其能使糖基和天然產物之間形成特定的糖苷鍵來合成糖苷類化合物，根據已收集的碳水化合物活性酶數據庫（CAZy，http://www.cazy.org/）及GTs氨基酸序列，將GTs分為114個家族［13］，目前發現的催化植物天然產物糖基化的酶常以尿苷二磷酸-糖為糖基供體，被稱為尿苷二磷酸依賴的糖基轉移酶（UGTs）［14］。在山芥［15］、姜狀三七［16］、甘草［17］、大豆［18］、苜蓿［19］等植物中已經分離出參與齊墩果烷型五環三萜皂苷生物合成途徑的關鍵糖基轉移酶基因，目前未見灰氈毛忍冬皂苷相關糖基轉移酶報道。

相關研究表明灰氈毛忍冬不同部位皂苷含量存在較大差異，花蕾的皂苷含量較高，較葉和莖中的皂苷含量高出幾個數量級［5］，且課題組前期研究發現灰氈毛忍冬花蕾不同發育階段皂苷含量存在差異。基于此，項目組對灰氈毛忍冬進行轉錄組測序分析，進一步從轉錄組數據中篩選到2個差異顯著的皂苷合成關鍵酶UGTs基因（UGTPg17、UGTPg36），其編號為DN53278_c0_g1（log2 Ratio：8.023 762 531）及DN45149_c0_g2（log2 Ratio：8.888 548 674）。利用RT?PCR克隆得到2個UGTs基因并對其編碼蛋白進行特征解析，采用實時熒光定量PCR分析基因在不同花期表達模式，HPLC法測定各個花期皂苷含量，并對表達量和皂苷含量進行相關性分析以探索UGTPg17及UGTPg36基因功能。

1 材料與方法

1.1 材料

灰氈毛忍冬樣品采于湖南省隆回縣，經湖南中醫藥大學周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.?Mazz.）樣品，根據課題組前期分期依據，將灰氈毛忍冬分為7個不同花期［20］，即花蕾初期（花期1）、青綠色花期（花期2）、綠白色花蕾期（花期3）、白色花蕾期（花期4）、白色開花期（花期5）、金黃色開花期（花期6）、枯萎期（花期7），其中花期4、花期5為藥典規定山銀花樣品（圖1）［21］。部分樣品用密封袋裝好，液氮速凍后保存于?80℃冰箱，用于提取RNA。部分樣品烘干后儲存，用于皂苷含量測定。

圖1 灰氈毛忍冬不同花期樣品Fig. 1 Flower samples at different flowering stages of L. macranthoides

灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（17021504，純度≥97%，成都普菲德生物技術有限公司），灰氈毛忍冬皂苷甲對照品（18120403，純度≥98%，成都普菲德生物技術有限公司），川續斷皂苷乙對照品（20072004，純度≥99%，成都普菲德生物技術有限公司）。本實驗所用其他試劑見表1，基因克隆、熒光定量PCR等引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，濃度均稀釋至10 μmol/L，具體引物序列見表2。

表1 實驗試劑Table 1 Reagents for experiment

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2 方法

1.2.1 灰氈毛忍冬各組織總RNA提取及cDNA的獲得 分別取灰氈毛忍冬各花期樣品適量，于研缽中加液氮研磨充分，利用多糖多酚試劑盒法（BiospinPlant Total RNA Extraction Kit）分別提取各花期總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測RNA的完整性和純度。選取高質量的RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國賽默飛）說明書，逆轉錄合成灰氈毛忍冬各花期cDNA。

1.2.2 UGTPg17、UGTPg36基因引物設計 根據灰氈毛忍冬花、葉轉錄組數據Unigene序列，通過NCBI比對確定ORF區域，根據ORF序列設計特異性克隆引物（表2）。

1.2.3 目的片段的克隆、回收及測序 以逆轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。采用25 μL PCR反應體系包括：2×Pfu MasterMix（Dye）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，UGTPg17?F 1 μL，UGTPg17?R 1 μL，cDNA 1 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，循環反應40次；最后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的條帶經膠回收試劑盒回收純化（北京擎科），回收產物連接pEASY??T1 Cloning Vector克隆載體后轉化TreliefTM5α感受態細胞，涂布于含有Amp，IPTG，X?gal的固體培養基進行藍白斑篩選，挑選白色菌落進行PCR鑒定后選取陽性克隆過夜培養，次日送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 UGTPg17、UGTPg36生物信息學分析 通過在線軟件（表3）對UGTPg17、UGTPg36蛋白進行生物信息學分析；將氨基酸序列上傳NCBI數據庫中進行Blastp比對，篩選出同源性相對較高的物種，導入DNAMAN軟件進行氨基酸多重序列比對分析；利用MEGA 7.0以鄰接法構建系統進化樹。

表3 生物信息學分析網站Table 3 Websites on bioinformatics analysis

1.2.5 UGTPg17、UGTPg36基因不同花期表達量分析 根據灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因序列，設計適用于熒光定量PCR的特異性引物（表2）。以18S基因為內參［22］，設計引物18S?F和18S?R。將提取的灰氈毛忍冬各花期的總RNA定量至相同濃度（約90 ng/μL），逆轉錄成cDNA，采用Bio?Rad CFX96進行熒光定量分析。反應體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×TransStart?Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，超純水8.2 μL。擴增程序（全式金兩步法）為50℃ 2 min，94℃預變性10min；94℃變性5 s，55℃退火15 s，40個循環。每個樣品3次生物學重復，反應完成后以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.6 灰氈毛忍冬皂苷含量測定

1.2.6.1 對照品溶液制備 精密稱取灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙對照品適量，用70%甲醇溶解制得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，制得對照品溶液，在“1.2.6.3”項色譜條件下進樣檢測。

1.2.6.2 供試品溶液制備 分別取過60目篩的灰氈毛忍冬不同花期樣品約0.1 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液10 mL，稱量，超聲提取30 min后取出冷卻至室溫，補足失重，離心，取上清液經0.45 μm濾膜過濾，制得樣品溶液，在“1.2.6.3”項色譜條件下每個樣品重復進樣3次。

1.2.6.3 色譜條件 采用Agilent Technologies 1260 Infinity液相儀，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A），0.4%磷酸水（B），進行梯度洗脫（0-15 min，90%B；15-17 min，90%-88% B；17-20 min，88%-84.6% B；20?22 min，84.6%-78.6% B；22-34 min，78.6%-78.2% B；34-40 min，78.2%-70% B）流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長210 nm，柱溫30℃［23］。

1.2.7 灰氈毛忍冬UGT基因表達量與皂苷含量相關性分析 分別將灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達量與皂苷含量峰面積導入SPSS 23數據統計軟件，對兩者進行Pear?son相關性分析。

2 結果

2.1 總RNA提取

灰氈毛忍冬不同花期的總RNA瓊脂糖凝膠電泳見圖2，可見28S和18S條帶明顯，說明RNA完整性較好，A260/A280值在1.8-2.0，A260/A230值大于2.0，RNA質量符合后續實驗要求。

圖2 灰氈毛忍冬各花期總RNA提取Fig. 2 Extraction of total RNA from the L macranthoides in different flowering stages

2.2 UGTPg17、UGTPg36基因的克隆

RT?PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3，分別在約1 400 bp、1 450 bp處有1條清晰條帶，條帶長度符合UGTPg17、UGTPg36基因編碼區開放閱讀框大小，故推測成功擴增相關目的基因。通過DNAMAN比對，測序所得的序列與Unigene模板序列匹配。

圖3 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36 PCR產物Fig. 3 PCR product of UGTPg17 and UGTPg36 gene cloned from L. macranthoides

2.3 UGTPg17、UGTPg36生物信息學分析

2.3.1 UGTPg17、UGTPg36基因序列分析 根據NCBI與轉錄組數據比對結果，將獲得的灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因進行命名并將序列上傳至NCBI數據庫，獲得基因登錄號為Lm?UGTPg17（GenBank：OP326755），Lm?UGTPg36（GenBank：OP331224）。Lm?UGTPg17，Lm?UGTPg36基因ORF全長分別為1 410 bp、1 428 bp，分別編碼469、475個氨基酸。

2.3.2 UGTPg17、UGTPg36蛋白理化性質 利用ExPASy Protparam在線分析軟件預測蛋白基本理化性質，推測灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36相對分子質量分別為52.66 kD，53.47 kD；蛋白分子式分別為C2393H3692N622O688S15、C2400H3720N684O687S10。LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白不穩定系數＞40，推測其均屬于不穩定蛋白。NetOGly 4.0分析推測LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白分別包含4個、7個糖基化位點。ProtScale在線預測蛋白親/疏水性，結果顯示LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白平均疏水指數（GRAVY）分別為?0.161、?0.244（負值），推測LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白為親水性蛋白。通過在線軟件WOLF PSORT進行亞細胞定位預測，結果表明LmUGTPg17蛋白定位于葉綠體（chloroplast）中定位系數為6，LmUGTPg36蛋白定位于細胞核（nucleus）中定位系數為7。Signal P 4.1 Server 軟件預測可知LmUGTPg17蛋白平均S值＞0.5，推測其可能含有信號肽，LmUGTPg36蛋白平均S值＜0.5，推測其不存在含信號肽序列。運用在線軟件TMHMM2.0分析LmUGTPg17、LmUGTPg36編碼蛋白跨膜結構表明，兩者均不具跨膜區域且均在膜外。

2.3.3 UGTPg17、UGTPg36蛋白結構域和二、三級結構預測 通過NCBI網站CD?Search在線工具分析灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白質結構域，結果如圖4。LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白均屬于Glycosyltransferase_GTB?type、Yjic超基因家族成員，均包含GT1_Gtf?like特殊結構域。

圖4 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白結構域預測Fig. 4 Domain prediction of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）proteins

通過SOPMA在線預測灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白二級結構，結果如圖5，LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白中α螺旋（alpha helix）分別占34.62%和42.53%，無規則卷曲（random coil）分別占44.87%和38.32%，β轉角（beta turn）分別占6.41%和5.26%，延伸鏈（extended strand）分別占14.10%和13.89%。無規則卷曲和α螺旋為灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36編碼蛋白二級結構的主要結構組成元件。通過SWISS?MODEL軟件，在線預測得到灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白三級結構，結果見圖6。

圖5 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白二級結構Fig. 5 Secondary structure of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）proteins

圖6 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）蛋白三級結構預測Fig. 6 Prediction of tertiary structure of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）protein

2.3.4 UGTPg17、UGTPg36氨基酸序列同源性比對和系統進化樹分析 利用NCBI中的BlastP對LmUGTPg17、LmUGTPg36氨基酸序列進行比對，下載同源性較高的幾個物種的氨基酸序列。UGTPg17蛋白與人參Panax ginseng、伊德斯種咖啡Coffea eugenioides、萵苣Lactuca sativa、茶Camellia sinensis、向日葵Helianthus annuus、小飛蓬Erigeron canadensis、紫花風鈴木Handroanthus impetiginosus、黃花蒿Artemisia annua、獨腳金Striga asiatica、獨腳金屬雜草Striga hermonthica等同源性達59.21%-67.89%。運用DNAMAN進行多序列比對，顯示LmUGTPg17與其他物種UGTPg17氨基酸序列總相似度達69.96%，比對結果如圖7。UGTPg36蛋白與山梨獼猴桃Actinidia rufa、人參Panax ginseng、紫花風鈴木Handroanthus impetiginosus等同源性達59.74%-60.59%。運用DNAMAN進行多序列比對，顯示LmUGTPg36與其他物種UGTPg36氨基酸序列總相似度達71.31%，比對結果如圖8。

圖7 LmUGTPg17蛋白與多種植物UGT蛋白序列比對Fig. 7 Multiple sequences alignment of LmUGTPg17 with UGT protein of other plants

圖8 LmUGTPg36蛋白與多種植物UGT蛋白序列比對Fig. 8 Multiple sequences alignment of LmUGTPg36 with UGT protein of other plants

利用MEGA7.0.21構建NJ進化樹，灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白與其他植物UGT蛋白系統進化樹見圖9，系統進化樹聚為兩大分支，灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36均與人參Panax ginseng同源性最高。

圖9 LmUGTPg17、LmUGTPg36蛋白與多種植物UGT家族蛋白系統進化樹Fig. 9 Phylogenetic tree of LmUGTPg17 and LmUGTPg36 with UGT protein from other plants

2.4 UGTPg17、UGTPg36基因在不同花期特異性表達

用RT?qPCR檢測UGTPg17、UGTPg36基因在灰氈毛忍冬不同花期中表達情況（圖10），結果表明兩個基因在7個花期中均有表達且趨勢相似，在前3個花期中表達量相對低，在后4個花期中表達量較高，UGTPg17基因在后4個花期的表達量均較UGTPg36基因表達量高出2倍以上。

圖10 LmUGTPg17（A）、LmUGTPg36（B）基因在不同花期中表達模式Fig. 10 Expression patterns of LmUGTPg17（A）and LmUGTPg36（B）in different flowering stages of L. macranthoides

2.5 灰氈毛忍冬皂苷含量測定

對灰氈毛忍冬不同花期灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲進行含量測定，色譜圖中3種皂苷色譜峰與其他色譜峰分離度良好（圖11）?；覛置潭煌ㄆ谠碥蘸孔兓厔菀妶D12，灰氈毛忍冬中皂苷類成分以灰氈毛忍冬皂苷乙為主，不同花期中3種皂苷含量高低順序為：灰氈毛忍冬皂苷乙＞川續斷皂苷乙＞灰氈毛忍冬皂苷甲，各花期間總皂苷含量差異較小，整體表現為前3個花期總皂苷含量相對較高，后4個花期總皂苷含量相對較低。

圖11 對照品溶液（A）和灰氈毛忍冬樣品溶液（B）的 HPLC圖譜Fig. 11 HPLC profiles of reference substance（A）and L. macranthoides sample solution（B）

圖12 灰氈毛忍冬不同花期皂苷含量趨勢Fig. 12 Trend of saponins at different flowering stages of L. macranthoides

2.6 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達量與不同花期總皂苷含量相關性分析

灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達量與不同花期皂苷含量做相關性分析（表4），UGTPg17、UGTPg36基因表達量與灰氈毛忍冬皂苷乙、總皂苷含量呈極顯著負相關，與灰氈毛忍冬皂苷甲、川續斷皂苷乙含量呈負相關，即基因表達量增加時皂苷含量下降，基因表達量減少時皂苷含量增加。

表4 灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因表達量與皂苷含量相關性法分析Table 4 Correlation analysis between the gene expression of UGTPg17 and UGTPg36 and the content of saponins of L. macranthoides

3 討論

皂苷類化合物是許多藥用植物的藥效成分，隨著皂苷類化合物在醫藥、食品、化妝品等行業的廣泛使用，其生物合成途徑也在不斷進行研究，參與皂苷生物合成的關鍵酶包括氧化鯊烯環化酶（OSCs）、細胞色素P450（CYP450s）及糖基轉移酶（UGTs），其中UGTs催化的糖基化反應通常被認為是皂苷生物合成的最后一步，是皂苷多樣性和生物活性形成的關鍵環節［24-25］，因此對UGTs基因的研究在探索灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑中具有重要意義。

UGTPg基因主要歸屬于UGT71、UGT74、UGT94家族，在人參皂苷生物合成途徑研究中較為廣泛，例如從人參中克隆得到的UGTPg45具有糖基化原人參二醇C3?OH的作用，UGTPg1能夠糖基化C20?OH［24］；后續在人參中分離出的UGTPg100和UGTPg101，前者可催化原人參三醇的C6?OH糖基化生成人參皂苷Rh1，后者可催化原人參三醇的C20?OH糖基化生成人參皂苷F1，再進一步催化C6?OH糖基化生成人參皂苷Rg1［25］。在對催化糖鏈延長的UGTs的研究中發現，UGTPg29具有延長C3?糖鏈的作用［24］；UGTPg71A29能夠延長人參皂苷Rd的C20?糖鏈［26］；PgUGT94Q15能夠延長人參皂苷Rh2的C3?糖鏈生成Rg3以及延長人參皂苷F2C3?糖鏈生成Rd，PgUGT94Q15?V1延長金盞花苷E（calenduloside E）的C3?糖鏈生成姜狀三七皂苷R1（zingibroside R1），且這兩個基因均能延長3?O-β-Glc齊墩果酸（3GOA）的C3?糖鏈生成3?O?［β-D?吡喃葡萄糖?（1→2）-β-D?吡喃葡萄糖］?齊墩果酸［27］。為進一步研究UGTPg17、UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑中的作用，通過NCBI下載山芥、苜蓿、姜狀三七、竹節參中已報道的參與齊墩果烷型五環三萜類化合物糖基化作用的糖基轉移酶基因，與本研究克隆所得Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因進行比對，發現灰氈毛忍冬中UGTPg17、UGTPg36基因與已報道的17條UGTs基因總同源性為61.43%，表明本研究克隆所得基因可能參與灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑，發揮類似的糖基化作用。

在植物中皂苷生物合成為多基因及多物質共同調控的結果，本實驗結果為探索Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷合成途徑中的具體功能奠定研究基礎，后續將通過轉基因技術，將克隆所得Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因分別轉化至灰氈毛忍冬愈傷組織中，培養鑒定得到陽性轉化植株，對轉基因愈傷組織進行HPLC?MS檢測，分析Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因在灰氈毛忍冬皂苷生物合成途徑具體功能。

4 結論

本研究成功克隆得到灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36基因，其編碼蛋白LmUGTPg17包含4個糖基化位點，LmUGTPg36包含7個糖基化位點，均屬于不穩定、親水性蛋白，不具跨膜區域；UGTPg36蛋白不存在信號肽序列，UGTPg17蛋白可能含有信號肽；進化樹分析發現灰氈毛忍冬UGTPg17、UGTPg36蛋白均與人參親緣關系最近。通過分析不同花期基因表達量與皂苷含相關性得出，Lm?UGTPg17、Lm?UGTPg36基因與灰氈毛忍冬總皂苷含量呈極顯著負相關，推測2個UGTs基因均與灰氈毛忍冬皂苷合成密切相關。