香蕉中ABA 醛氧化酶基因家族的鑒定及其表達分析

曾堅，周潔薇，王舒婷，胡偉

(1. 韶關學院廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室/英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口 571101)

脫落酸(abscisic acid，ABA)屬于六種植物激素之一，1963 年首次在脫落果實中被鑒定為生長抑制劑[1]，隨后發現其在種子休眠、萌發、氣孔開合、果實發育等多種生理過程中發揮著重要作用[2-4]，在水楊酸介導的生物脅迫以及高鹽、干旱和寒冷等非生物脅迫中也起著關鍵作用[3，5]。ABA 的代謝過程已有相關研究綜述進行了詳細總結[6]。 ABA 合成過程主要涉及玉米黃質環氧化酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)、9-順環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases，NCEDs)、短鏈醇脫氫酶/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)、ABA 醛氧化酶(abscisic aldehyde oxidase，AAO)[7]，其中AAO 參與ABA 合成途徑中的最后一步。 雖然ABA 合成相關基因的研究比較多[8]，但關于AAO基因的研究較少，目前只對少數幾個物種如擬南芥[9]、水稻[10]、小麥[11]等的AAO基因家族進行了鑒定分析。 如:在擬南芥中，AtAAO3基因的突變會導致ABA 含量降低[9]；番茄ABA 缺陷型突變體中的AAO 活性遠低于野生型的[12]，大麥中也存在類似的AAO 缺失或活性降低的現象[13]。

香蕉(Musassp.)是世界上重要的熱帶水果之一，也是重要的糧食作物之一[14]。 香蕉在生長過程中會遭受到低溫、干旱、香蕉枯萎病等不同逆境的影響，對其產量和最終果實品質產生重要影響[15-16]。 ABA 在這些過程中都扮演著重要的角色，因此，研究香蕉AAO家族基因種類及其在不同逆境處理下的表達情況具有重要意義。 本研究從香蕉基因組中鑒定得到了AAO家族基因，并分析了它們的進化關系、基因結構和蛋白結構域，同時分析了其在不同組織、果實發育和成熟的不同階段及對非生物/生物脅迫響應的表達模式，以期為進一步明確MaAAOs基因在香蕉生長發育和脅迫反應過程中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用口味優良的香蕉品種粉蕉(MusaABB Pisang Awak，FJ) 進行試驗。 將粉蕉組培苗種植于塑料盆中(無菌土壤)，培養于生長室(28 ℃，70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強度為200 μmol·m-2·s-1)。 組培苗種植取樣周期為2015 年6 月—2016 年8 月。

1.2 試驗處理與樣品采集方法

(1)不同組織樣品采集:組培苗種植約70 天后達到五葉期，此時選取葉和根；組培苗種植約10 個月開始開花，于開花后0 天(0 DAF)、20 DAF 和80 DAF 選取果實；組培苗種植12 ～13 個月后采收，選取采收后3 天(3 DPH)和6 DPH 的果實。 每個樣本進行兩次生物學重復，用于分析基因在不同組織和果實發育不同階段的表達情況。

(2)非生物脅迫處理方法及取樣:分別用300 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1甘露醇灌溉五葉期香蕉幼苗，進行鹽脅迫和滲透脅迫處理，處理7 d 后取樣；將五葉期香蕉幼苗置于4 ℃生長室(70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強度為200 μmol·m-2·s-1)進行冷脅迫處理，22 h 后取樣。 采集對應處理時間后的葉片樣本進行非生物脅迫處理下基因的表達分析。

(3)尖孢鐮刀菌侵染處理及取樣:將五葉期香蕉幼苗根部浸泡在F. oxysporumrace 4(Foc4)孢子懸液(106個分生孢子/mL)中2 h，以浸入無菌蒸餾水(ddH2O)中的為對照；然后移栽到裝有無菌土壤的塑料盆中，在生長室中培養(28 ℃，70%濕度，光周期為16 h 光/8 h 暗，光照強度為200 μmol·m-2·s-1)；培養2 d 后，采集根系樣品進行基因表達分析。 每份樣本包含兩個生物重復樣本。

1.3 香蕉AAO 基因家族的鑒定及系統發育分析

利用擬南芥AtAAOs基因的序列構建HMM模型，從香蕉A 基因組中搜索得到香蕉AAOs序列；利用得到的香蕉AAOs序列構建新的HMM 模型，利用新的HMM 模型從A 基因組中搜索鑒定MaAAOs基因。 使用保守結構域數據庫(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和PFAM 數據庫(http:/ /pfam.sanger.ac.uk/)驗證得到的MaAAOs基因。 利用下載得到的AtAAOs 和水稻OsAAOs 蛋白序列，以MEGA-X 中的MUSCLE 方法進行序列比對，使用Neighbor-joining 法構建系統發育樹，Bootstrap 值設置為1 000。

1.4 香蕉AAO 基因家族的蛋白質特性和序列分析

通過ExPASy 數據庫(http:/ /expasy.org/)對分子質量和等電點等理化性質進行預測。 利用MEME 軟件和InterProScan 數據庫對蛋白結構域序列進行鑒定。 采用GSDS 數據庫對基因結構進行分析(http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)。

1.5 轉錄組分析

RNA 測序中的RNA 提取、文庫制備和測序等工作均由美吉生物技術有限公司(中國上海)完成。 RNA-seq 分析樣本的收集過程參考前人的研究[17]。 每個樣本包含兩個生物重復序列。測序平臺為Illumina GAII (Illumina， San Diego，CA， USA)。 FASTX(http:/ /hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)和FastQC(http:/ /www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)用于刪除接頭序列和低質量序列。 通過Tophat V.2.0.10 將粉蕉樣本的clean reads 與香蕉基因組進行比對[18]，使用Cufflinks 進行轉錄組組裝[19]。 基因的表達值使用FPKM 值表示。 使用DEGseq 工具鑒定差異表達基因(DEGs) (log2-based fold change＞1；log2-based fold change＜-1)。

2 結果與分析

2.1 MaAAOs 基因的鑒定

利用香蕉AAO基因序列的保守結構域構建HMM 模型，從香蕉A 基因組中鑒定得到了3 個MaAAOs基因，分別命名為MaAAO1、MaAAO2、MaAAO3(表1)，其氨基酸殘基數量分別為1 365、1 393、1 399 個，編碼蛋白的分子量范圍為15.05～15.26 ku，等電點范圍是6.59 ～6.62。 為分析MaAAOs 的進化關系，分別下載了水稻和擬南芥AAO基因家族的蛋白質序列(表1)，采用NJ 法構建了系統發育樹(圖1)。 可見，所有AAO 蛋白可以分成兩類，MaAAO2 和MaAAO3 與所有AtAAOs及大部分OsAAOs 聚在一個亞類，而MaAAO1 則與兩個OsAAOs 聚成一個亞類。

圖1 AAO 家族蛋白系統進化樹

表1 AAO 基因信息

2.2 MaAAOs 基因家族的結構域和基因結構分析

利用MEME 數據庫從MaAAOs基因中鑒定得到10 個保守結構域，并用InterPro 數據庫進行了注釋。 由結果(圖2、表2)可見，3 個MaAAOs基因表現出類似的結構域組成，僅MaAAO1缺少了Motif8；除了Motif7，其余9 個Motif 都含有結構域IPR016208，其功能被注釋為醛氧化酶/黃嘌呤脫氫酶。 隨后對MaAAOs基因結構進行分析，MaAAO2和MaAAO3有類似的基因結構，都有10個內含子；而MaAAO1的內含子則是14 個(圖3)。 表明相同聚類有類似的結構域組成和基因結構，與系統發育樹的分析結果相一致。

圖2 MaAAOs 基因結構域

圖3 MaAAOs 基因的結構分析

表2 MaAAOs 基因結構域的注釋

2.3 MaAAOs 在粉蕉不同組織中的表達

如圖4A 所示，粉蕉根中MaAAO1和MaAAO3基因高表達(FPKM＞5)，葉中3 個MaAAOs基因都表現出高表達，而果實(80 DAF)中則只有MaAAO1表現出高表達。 3 個MaAAOs基因中，只有MaAAO1在粉蕉根、葉和果實中都呈現出高表達。

圖4 MaAAOs 基因在香蕉不同組織(A)、果實不同發育階段(B)、不同逆境處理(C)中的表達分析

2.4 MaAAOs 在粉蕉果實不同發育階段中的表達

為明確MaAAOs基因在香蕉果實發育過程中的功能，對其在不同發育階段果實中的表達情況進行了分析，結果(圖4B)顯示，只有MaAAO1在果實發育早期(0 DAF 和20 DAF)和后期(80 DAF、3 DPH)中表現出高表達(FPKM＞5)，且以3 DPH 果實中的表達量最高；MaAAO2在果實發育整個階段的表達都極低；MaAAO3在果實各發育階段的表達水平相比MaAAO2要高，但除20 DAF外均沒有達到高表達。 因此推測MaAAO1可能在果實發育過程中發揮著重要作用。

2.5 MaAAOs 在不同逆境處理下的表達

為分析MaAAOs基因在粉蕉應對逆境脅迫中的功能，設置生物和非生物脅迫處理，分析3 個MaAAOs基因在粉蕉植株根中的表達情況，結果(圖4C)顯示，在Foc4 處理下，MaAAO2基因表現出上調(log2-based fold change＞1)；在滲透脅迫下，MaAAO1和MaAAO2基因表現出上調；在冷和鹽脅迫下，3 個基因均未表現出明顯的上調表達；MaAAO3基因在所有逆境處理中都沒有表現出顯著變化。

3 討論

香蕉既是一種重要的熱帶和亞熱帶水果，也是全球130 多個國家的主糧，但其研究進展相比其它作物要慢[20]。 ABA 在植物的生長發育和生物/非生物脅迫響應中起著重要作用[21]，而AAO是ABA 合成途徑中的重要合成酶，但香蕉AAO基因家族的情況仍不清楚。 本研究從香蕉A 基因組中鑒定出3 個MaAAOs基因，保守結構域分析證明這3 個基因屬于AAO家族，并根據系統發育樹將其分為兩個亞類， 其中MaAAO2和MaAAO3聚為一類。 擬南芥的AAO基因數量是4個[9]，水稻中可能是5 個[10]，小麥中是3 個[11]，數量均較少，表明AAO 蛋白可能屬于小基因家族編碼的蛋白質。

香蕉果實的發育和成熟過程決定著果實的品質和產量[14]。 研究表明，ABA 信號參與了果實的生長發育并影響著果實的成熟過程和最終品質；未成熟水果中的內源ABA 含量通常較低，施加外源ABA 能促進果實成熟及果肉軟化；果實成熟過程中ABA 合成相關基因的表達上調導致內源ABA 大量積累[22]。 這些結果表明ABA 在水果成熟過程中發揮著重要作用。 在本研究中，不同MaAAOs基因在粉蕉果實不同發育階段表現出不同的表達模式，MaAAO1基因在早期和晚期都表現出高表達，而MaAAO2和MaAAO3幾乎不表達；此外，MaAAO1在粉蕉葉、根、果實中均表現出高表達，推測MaAAO1基因在香蕉果實發育和成熟過程中可能具有重要作用。

香蕉生長過程中常會遇到干旱、鹽、寒冷以及枯萎病菌感染等非生物和生物逆境，對果實品質及產量造成影響[15-16]。 在擬南芥中，AtAAO3和AtAAO1基因表達明顯受到干旱脅迫的誘導[9，23]；在擬南芥中過表達花生AhAAO2基因也能顯著提高植株抵抗干旱脅迫的能力[24]。 本研究發現，MaAAO1和MaAAO2基因受滲透脅迫誘導上調表達，但受冷和鹽脅迫的影響很?。籑aAAO3基因的表達在3 種脅迫下均無顯著變化。 表明MaAAO1和MaAAO2基因可能在香蕉響應干旱脅迫中發揮作用。 香蕉的種植生產也受到香蕉枯萎病的嚴重影響。 有研究表明ABA 能負向調控水楊酸(SA)介導的病原體反應，例如，提高植株中ABA 的含量，會顯著促進細菌的生長[25]。 在本研究中，僅MaAAO2基因的表達顯著受到Foc4 處理的誘導，表明這個基因可能參與了響應Foc4 侵染的過程。

4 結論

本研究從香蕉A 基因組中鑒定得到了3 個MaAAOs基因，經系統發育分析、蛋白結構域和基因結構分析，確定屬于AAO基因家族。MaAAOs基因參與了香蕉的生長發育、果實成熟和對生物/非生物脅迫的響應等過程。 其中，MaAAO1基因在果實發育早期和成熟階段都表現出高表達；MaAAO1和MaAAO2基因對滲透脅迫有響應；MaAAO2基因的表達被Foc4 誘導，可能響應該病菌的侵染。