基于高通量測序技術解析中高溫制曲真菌群落的演替規律研究

楊 勇，葛向陽，2*，張聰芝，李燕榮，賈亞偉

(1.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800；2.宿遷學院，江蘇宿遷 223800)

大曲作為一種富含多酶多菌的微生態制品，在 中國白酒的釀造過程中起著糖化、生香、發酵、提供菌源的作用，是傳統固態發酵蒸餾大曲酒的重要物質保障，被人們評價“曲為酒之骨”[1]。對大曲中真菌微生物的研究最早是通過傳統的分離培養方法，葛向陽等[2]經過多級富集、分離、純化與鑒定，從洋河傳統包包曲中分離得到畢赤酵母屬、異常漢遜酵母、假絲酵母等酵母菌類群以及卷枝毛霉、寄生曲霉、黑曲霉和黃曲霉等霉菌類群；羅惠波等[3]發現瀘州老窖大曲內存在大量的曲霉屬、根毛霉屬、橫梗霉屬等霉菌類群以及釀酒酵母、德巴利氏酵母屬、異常威克漢姆酵母、鎖擲酵母屬等酵母菌類群。對中高溫制曲發酵過程中可培養微生物的消長及生化指標的變化規律也做了相關研究[4-5]，然而，傳統的分離培養方法受到培養基的選擇性、微生物的生長特性等因素影響[6]，很難直接展現大曲中微生物的真實群落結構。

隨著分子生物學的發展，基于免培養的高通量測序技術已經越來越廣泛地應用于微生物群落的研究。譚崇堯等[7]利用高通量測序發現北方派濃香型白酒大曲優勢真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、威克漢姆酵母屬等，長江中游派優勢真菌為曲霉屬、熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬，江淮派優勢真菌有曲霉屬、熱子囊菌屬、耐干霉菌屬等，川派優勢真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬等；吳樹坤等[8]利用高通量測序發現四川不同地區濃香型白酒大曲中優勢真菌為嗜熱真菌屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、絲衣霉屬、節擔菌屬；施思等[9]利用高通量測序技術發現濃香型白酒大曲在貯存過程中的真菌群落結構不斷調整，畢赤酵母屬、根霉屬及橫梗霉屬成為最終的優勢菌群；Li[10]對不同工藝的中、低溫大曲的微生物群落變化進行研究，發現在不同環境作用下，微生物群落結構會發生改變。

基于高通量測序技術，已經對細菌群落演替規律進行了相關分析[11]。本文以中高溫大曲為研究對象，采用高通量測序技術對培菌發酵幾個主要階段的真菌群落進行分析，研究各階段優勢真菌的分布、豐度及其在培菌發酵過程中的演替規律，為進一步剖析制曲發酵機理提供可靠的微生物信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：中高溫大曲培養過程中入房（編號：RF，發酵0 天）、并房（編號：BF，發酵5 天）、上架（編號：SJ，發酵9 天）、大火（編號：DH，發酵15天）、下架（編號：XJ，發酵21 天）、出房（編號：CF，發酵35 天）各個階段的混合樣，分別粉碎、混勻、裝袋，于-80 ℃保存備用。

試劑耗材：TaKaRa Premix Taq?Version 2.0、E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit (Omega，USA)、NEBNext? Ultra ?II DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）。

儀器設備：Novaseq 6000 PE250 平臺、美國Bio-Rad Laboratory S1000 型PCR 儀、Thermo Nano-Drop One。

1.2 實驗方法

按照標準流程對大曲樣品進行DNA 提取，以ITS5-1737F 和ITS2-2043R 為引物進行PCR 擴增，每個樣本進行3 個重復，并將同一樣本的PCR 產物進行混合，然后電泳檢測、切膠純化、建庫測序。

2 結果與分析

2.1 測序有效性分析

中高溫制曲各階段真菌的richness 曲線如圖1所示。結果顯示，隨著測序深度的增加，各樣本的richness 指數曲線都是先增加后逐步趨于平緩，說明測序數據量足夠大，可以反映中高溫制曲各階段樣本中的絕大多數物種信息。

2.2 Alpha多樣性分析

對中高溫制曲各階段的真菌群落進行Alpha多樣性分析，結果見表1。所有樣本的coverage 均大于0.99，說明該結果能夠真實反映真菌群落結構。剛入房時，真菌豐度與菌群多樣性都較低，說明自然接種的微生物種類與數量都較低；主發酵期，曲心溫度升高，真菌大多不耐熱，導致并房后真菌的豐度與菌群多樣性都降至最低；此后進入潮火期，隨著曲心溫度進一步升高，能夠適應高溫的真菌種類在大曲中不斷富集，因此上架時的真菌豐度與菌群多樣性都開始升高；隨著曲心溫度保持60 ℃左右進入占火，嗜熱真菌進一步增殖，曲皮水分也喪失殆盡，大火期的真菌豐度與菌群多樣性進一步升至最高值；經過大火期的高溫馴化與淘汰，下架時的真菌豐度與大火期相當，但菌群多樣性降低；此后進入養曲期，曲心水分進一步降低，干燥缺水的環境逐漸不適合真菌的生長，因此出房時的真菌豐度基本不變，菌群多樣性也進一步降低。

表1 大曲培養各階段真菌Alpha多樣性指數

2.3 OTU分布Venn分析

通過對中高溫制曲各階段的OTU 進行統計分類，Venn 分析結果如圖2 所示。結果顯示，真菌有11 個OTUs 是共有的；從入房到并房，真菌無變化；上架時緩慢增加；進入大火期，真菌快速增加至最高點；下架時，真菌緩慢下降；出房時，真菌有所回升。

圖2 大曲培養各階段真菌OTUs交疊Venn圖

2.4 不同分類水平的物種變化

通過合并相同物種分類的OTUs，從門、綱、目、科、屬不同分類水平，統計平均含量前15 的物種，其余的物種歸于others 中，根據百分比繪制真菌的分布柱狀圖，結果見圖3與圖4。

圖3 大曲培養各階段真菌在門、綱、目與科水平上的分布變化

圖4 大曲培養各階段真菌在屬水平上的分布變化

從圖3 中可以看出，不同培養階段大曲中的真菌都是以子囊菌門和毛霉門為主，兩者占比超過90%以上，其中子囊菌門包括半子囊菌綱的酵母目和散囊菌綱的散囊菌目，毛霉門即毛霉綱的毛霉目。毛霉目前期很少，上架后才大量繁殖，豐度占比高達42 %，大火期間降至11 %，下架后回升至32%，出房后又緩落至20%；酵母目的豐度則先緩升后不斷下降，入房時即高達88 %，并房后升至99%以上，之后開始快速下降，上架、大火、下架時分別下降至52%、31%、6%，出房時回升至8%；散囊菌目則先下降后上升，入房時占比10%，而后緩慢下降至3 %，大火后迅速生長繁殖，豐度占比高達57 %，而后維持較高水平，下架、出房時分別為53%、70%。

從科水平看，以相對豐度1 %為下限，共檢測到12 個真菌科。入房時以酵母科、發菌科、曲霉科和法夫酵母科為主，占比分別為25%、22%、18%、16 %，此外還有豐度不足5 %的雙足囊菌科、德巴列酵母科、根霉科、橫梗霉。酵母科在并房后消失殆盡；發菌科先快速減少后逐漸增加，并房時消失殆盡，上架后開始逐漸增加，各個階段的豐度分別為2%、26%、54%、70%；曲霉科先減少、后增加、而后又減少，僅大火期高達32%，其他階段豐度都在1%～2%；法夫酵母科呈減少趨勢，并房時占比6 %，之后降至1 %以下；雙足囊菌科從入房時的4%增加至并房時的11%，而后降至1%以下，出房時回升至5%；德巴列酵母科在大曲培養各階段呈先增加后減少趨勢，上架和大火期豐度較高，分別為32 %、28 %；根霉科則呈波浪式變化，出房時豐度達10 %；屬于毛霉目的橫梗霉也大致呈先增加后減少趨勢，上架時豐度最高達56 %，出房時為11%。

在屬分類水平上，以相對豐度1 %為下限，共檢測到16 個真菌屬，結果如圖4 所示。入房時以孢圓酵母屬、嗜熱真菌屬、威克漢姆酵母屬和曲霉屬為主，占比分別為26%、21%、17%、14%；并房后，微生物群落發生顯著變化，主體微生物調整為柯達酵母屬、根毛霉屬、橫梗霉屬、威克漢姆酵母屬、生絲畢赤酵母屬、假絲酵母屬，豐度分別為35 %、19%、10%、6%、5%、5%；上架后，根毛霉屬、生絲畢赤酵母屬、橫梗霉屬的豐度分別增長至45 %、31 %、11 %；大火期，主體微生物轉變為30 %的曲霉屬、29%的生絲畢赤酵母屬、27%的嗜熱真菌屬和7%的根霉屬；下架后，嗜熱真菌屬、根毛霉屬大量增長至54 %、31 %；出房后，嗜熱真菌屬占據絕對優勢，豐度高達73%，此外還包括11%的根毛霉屬和10%的根霉屬。

2.5 群落分布特征

通過PCoA 主坐標分析與豐度聚類熱圖研究中高溫制曲各階段真菌群落分布特征，結果顯示，圖5 中的第一軸能夠解釋數據64.6%的變量，第二軸能夠解釋數據18.5 %的變量，兩軸和為83.1 %。結合樣品在分布圖中的距離及其豐度聚類熱圖，可將真菌變化趨勢的類型分為四類：（1）在入房和并房階段，距離接近、同處于第二象限且聚為一類，說明這兩個階段的真菌群落結構相似，可歸為同一階段，其中孢圓酵母屬主要在入房階段，柯達酵母屬主要在并房階段；（2）上架時，樣本與入房和并房階段距離較遠，且單獨位于第三象限，可單獨歸為一類，此時伴隨溫濕度等環境因子的變化，大曲中水分營養充足，微生物結構不斷進行適應性調整，橫梗霉屬大量生長至最高豐度，假絲酵母屬、粉狀米勒氏酵母屬等豐度也升高；（3）大火期，樣本與入房、并房和上架階段的距離都較遠，且單獨位于第四象限，結合豐度聚類熱圖，也單獨歸為一類，此時溫度等環境因素達到極限，不耐熱微生物逐漸被淘汰，生絲畢赤酵母屬、曲霉屬、節擔菌屬、青霉屬大量生長至最高豐度；（4）下架雖然與大火期距離較近，但下架和出房樣本同位于第一象限且距離不遠，結合豐度聚類熱圖可將下架和出房樣本聚為一類，兩者可歸為同一階段，此時隨著品溫等環境因子漸趨溫和，微生物利用曲心殘留的水分和營養進行生長繁殖與演替，根毛霉屬、粉狀米勒氏酵母屬、橫梗霉屬及未知屬在下架時豐度占據絕對優勢，柯達酵母屬、假絲酵母屬、威克漢姆酵母屬、根霉屬在出房時豐度占據絕對優勢，嗜熱真菌屬、紅曲霉屬、羅薩氏菌豐度在下架和出房時都較高。

圖5 大曲培養各階段真菌主坐標分析圖

圖6 大曲培養各階段真菌群落豐度聚類熱圖

圖7 理化因子及酶活指標與真菌優勢屬的RDA分析

2.6 真菌群落與理化因子關聯分析

利用R 語言中RDA 分析和作圖，分析中高溫制曲過程中的真菌群落結構與理化指標之間的相關性。理化因子關聯分析發現，水分、糖化力、酯化力與真菌群落結構的相關性較高，發酵力其次，酸度與真菌群落結構的相關性較低，說明真菌主要對水分和酶活有較大影響，對酸度的影響較小。就主要優勢屬看，發酵力與生絲畢赤酵母屬相關性較高，與曲霉屬、青霉屬也有一定的相關性；酯化力與嗜熱真菌屬、紅曲霉、威克漢姆酵母屬相關性較高，與羅薩氏菌、柯達酵母屬、根霉屬也有一定的相關性；水分和糖化力則與孢圓酵母屬的相關性較高。

3 總結與展望

本研究采用高通量基因測序技術對中高溫制曲培養各階段真菌不同分類水平的組成與豐度進行了系統的研究，結果表明：在門水平上以子囊菌門和毛霉門為主，其中子囊菌門包括半子囊菌綱的酵母目和散囊菌綱的散囊菌目，毛霉門即毛霉綱的毛霉目；在科水平上，以酵母科、發菌科、曲霉科和法夫酵母科為主；屬水平上，嗜熱真菌屬、根毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、生絲畢赤酵母屬、橫梗霉屬、威克漢姆酵母屬分別在制曲過程不同時期占據主導地位，前期主要是酵母屬，為大曲的釀酒和生香提供菌源，后期主要是耐高溫霉菌類微生物，為大曲提供糖化、液化以及生香相關的微生物。唐清蘭等[12]采用高通量測序技術跟蹤濃香型白酒大曲制曲過程真菌群落結構變化，發現伊薩酵母屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬分別在制曲過程不同時期占據主導地位。不難發現，兩類大曲的真菌種類及其豐度存在明顯差異，這是由于大曲采用開放式生產、自然接種，環境、原料、工藝等對大曲微生物區系均有直接影響。

此外，本文通過RDA 分析首次發現真菌與水分和酶活關系密切。其中發酵力與生絲畢赤酵母屬相關性較高，生絲畢赤酵母屬是白酒發酵中的重要功能微生物，可以代謝產生風味物質，如乙酸乙酯、4-羥基-2-丁酮等[13-14]。酯化力與嗜熱真菌屬、紅曲霉、威克漢姆酵母屬相關性較高，其中嗜熱真菌屬耐高溫，最高生長溫度為50 ℃或以上，可產生嗜熱酶，包括纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等[12]；紅曲霉能分泌大量酯酶，對碳酸十四乙酯和苯乙醇的形成有促進作用[15]；威克漢姆酵母屬能夠將原料中的前體物質轉化成酯、酸、醇、醛等風味物質，對白酒風味形成有重要作用[16]。水分與孢圓酵母屬的相關性較高，孢圓酵母屬是非釀酒酵母菌，但通過其獨特的次生代謝物也可對酒的感官特性作出積極貢獻[15]。

通過研究，明確了中高溫制曲過程中真菌群落結構的演替規律，并首次解析了真菌種類與大曲的發酵和生香之間的潛在關系，有助于中高溫大曲真菌多樣性形成機制的解析，從而提高對大曲微生物認識的深度和廣度，為中高溫大曲生產提供參考與借鑒。下一步，我們將結合微生物與非生物因素進行關聯性分析，如溫度、濕度、氧氣、門窗管控等，以全面準確地研究中高溫大曲微生態演變的內在驅動力。