非諾貝特對酒精性肝病患者肝臟巨噬細胞極化及肝纖維化指標的影響

任玲玲 陳芳玲 陳 益 王立明 陳光蘭

酒精性肝病是由長期大量飲酒引起的、以肝細胞炎癥或壞死為主要病理變化的肝病類型，病情遷延可進展至酒精性肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭，嚴重影響患者的生活質量[1]。目前臨床治療酒精性肝病尚無特效藥，主要通過戒酒、鍛煉和對癥支持等方法緩解病情，但療效不夠理想[2]。近年來研究發現，除肝星狀細胞外，肝臟巨噬細胞也是肝臟炎癥反應的效應細胞，且在肝纖維化的發生和進展過程中發揮著重要作用[3]。研究表明，激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）可干擾激活蛋白-1（AP-1）/NF-κB 信號通路，從而抑制組織因子及促炎因子產生，增強肝臟巨噬細胞的抗纖維化作用，進而拮抗肝纖維化進程[4]。非諾貝特是臨床上常用的調脂類藥物，其亦是PPARα 激動劑。既往的研究報道多集中于非諾貝特治療非酒精性脂肪性肝病方面[5]，而關于非諾貝特治療酒精性肝病的報道較少。基于此，本研究探討了非諾貝特對酒精性肝病患者肝臟巨噬細胞極化及肝纖維化指標的影響，旨在為臨床治療提供更多參考。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年1 月至2022 年9 月麗水市第二人民醫院住院治療的100 例酒精性肝病患者作為研究對象，采用奇偶數字法將患者分為研究組和對照組，每組各50 例。納入標準：（1）18～80 歲；（2）符合《酒精性肝病診療指南 （2010 年1 月修訂）》[6]中的診斷標準；（3）B 超下經皮穿刺肝臟活體組織檢查結果示存在肝纖維化病變，肝纖維化分期為S1～S2 期[7]。排除標準：（1）入組前1 個月內接受酒精性肝病相關治療；（2）合并病毒性肝炎、肝硬化等其他類型肝病，或為非酒精性脂肪性肝病；（3）合并嚴重的心腦血管疾病、自身免疫病或惡性腫瘤；（4）近1 個月內使用過其他影響本研究結果的藥物；（5）妊娠期或哺乳期婦女；（6）患有精神、認知等障礙；（7）過敏體質或對非諾貝特過敏；（8）依從性差。剔除標準：（1）治療期間失訪；（2）無法堅持戒酒、飲食控制及鍛煉；（3）因病情反復等原因中斷治療。

研究組50 例中男性36 例，女性14 例；年齡23～72 歲，平均年齡為（51.45±8.79）歲；平均BMI 為（27.35±3.12）kg/m2；持續飲酒年限5 ～31年，平均持續飲酒年限為（18.58±9.37）年；每日乙醇攝入量80～160 g，平均每日乙醇攝入量為（115.23±23.98）g；病程3～8 年，平均病程為（6.49±1.24）年；肝纖維化分期S1 期19 例，S2 期31 例；有吸煙史24 例。對照組50 例中男性38 例，女性12例；年齡25～78歲，平均年齡為 （52.31±8.83）歲；平均BMI 為（27.21±3.14）kg/m2；續飲酒年限5～32 年，平均持續飲酒年限為（18.62±9.33）年；每日乙醇攝入量84～158 g，平均每日乙醇攝入量為（114.98±23.85）g；病程3～9 年，平均病程為（6.57±1.26）年；肝纖維化分期S1 期18 例，S2 期32 例；有吸煙史22 例。2 組在性別、年齡、BMI、持續飲酒年限、每日乙醇攝入量、病程、肝纖維化分期和吸煙史方面的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。所有入組患者均知情并簽署同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過（批件號：20230068）。

1.2 治療方法

對照組入組后進行常規干預治療，即戒煙、戒酒、低脂飲食及適量運動，補充維生素和微量元素，進行保肝、降酶治療；對于Maddrey 判別函數評分（MDF）＞32 分或終末期肝病模型（MELD）評分＞20 分的患者，給予糖皮質激素治療[8-9]。研究組在對照組的基礎上口服非諾貝特片（由江蘇恩華藥業股份有限公司生產，國藥準字H32022964，規格0.1 g/片），飯后服用，每次1 片，每日3 次，連續治療2 個月。

1.3 觀察指標

1.3.1 臨床療效判定 顯效指治療結束后患者惡心嘔吐、食欲減退、乏力、腹痛、體重減輕等臨床癥狀均完全消失，肝功能指標水平降至正常范圍，肝纖維化癥狀消退；有效指治療結束后患者臨床癥狀顯著改善，肝功能指標水平顯著下降，肝纖維化癥狀減輕；無效指治療結束后患者的臨床癥狀、肝功能指標、肝纖維化癥狀均無顯著改善[6,8]。

1.3.2 肝臟巨噬細胞的分離與培養 參考文獻10進行肝臟巨噬細胞的分離與培養[10]。B 超引導下行肝穿刺活體組織檢查，獲取肝組織，用含10%肝素的生理鹽水洗滌；用鑷子劃碎組織并裝入試管，以0.05%膠原酶Ⅱ消化，37 ℃孵育40 min，用200目細胞篩過濾；PBS 溶液稀釋，4 ℃下2 000 r/min離心10 min，棄上清；取沉淀，PBS 溶液沖洗2 ～3 次，每次5 min；將Percoll 細胞分離液（購自北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SY0531）與PBS 溶液以9 ∶1 比例混合，4 ℃下3 000 r/min 離心30 min；吸出白膜層后，PBS 溶液沖洗，得到單個核細胞；以含GM-CSF 因子的10%胎牛血清1640 培養基重懸細胞，置于6 孔板內，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養7 d。

1.3.3 肝臟巨噬細胞表型檢測 采用流式細胞術檢測肝臟巨噬細胞的表型。收集培養7 d 后的肝臟巨噬細胞，以F4/80-PE 和CD11B-FITC 標記M1 型巨噬細胞，以F4/80-PE 和CD206-FITC 標記M2 型巨噬細胞，流式抗體購自美國Sigma 公司，4 ℃下孵育3 min；PBS 溶液沖洗3 次，每次5 min；用PBS溶液重懸后，使用流式細胞儀（購自美國BD 公司，型號：FACSCalibur）檢測，應用CellQues Pro 軟件進行分析。

1.3.4 肝組織中M1 型和M2 型巨噬細胞標志物水平檢測 采用蛋白質印跡法測定肝組織中M1 型和M2 型巨噬細胞標志物水平。取肝組織，采用RIPA法充分裂解；4 ℃下4 000 g 離心15 min，收集上清液，采用BCA 法進行蛋白質定量；行常規電泳，濕法轉至PVDF 膜，5% BSA 封閉；滴加一抗，分別為抗誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（1 ∶1 000）、抗IL-1β 抗體（1 ∶3 000）、 抗IL-10 抗體（1 ∶3 000）、抗精氨酸酶-1（Arg-1）抗體（1 ∶1 000），以抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（1 ∶5 000）作為內參，以上抗體均購自美國Abcam 公司；4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min；滴加與一抗同種屬二抗（1 ∶5 000），室溫孵育2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；使用ECL 發光液（購自北京凱詩源生物科技有限公司，貨號：My35737）進行化學發光，使用凝膠成像儀（購自美國GE 公司，型號：ImageQuant100）顯像，應用Image ProPlus 6.0 軟件對條帶灰度值進行分析。iNOS 和IL-1β 為M1 型巨噬細胞標志物，IL-10 和Arg-1 為M2 型巨噬細胞標志物。

1.3.5 實驗室指標測定 分別于治療前及治療后抽取入組患者清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血清和血漿，在-20 ℃下保存待測；使用全自動生物化學分析儀（購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：BS-350S）測定血清ALT、AST、總膽紅素（TBil）、γ-谷氨酰轉移酶（GGT）、總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）水平。采用放射免疫法測定血清透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）和Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）水平，試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.4 統計學方法

應用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組臨床療效比較

經治療后，研究組中顯效21 例，有效23 例，無效6 例，總有效率為88.00% （44/50）；對照組中顯效13例，有效23例，無效14例，總有效率為72.00%（36/50）。與對照組相比，研究組治療后的總有效率顯著升高，差異有統計學意義（χ2=4.000，P=0.046）。

2.2 2 組肝臟巨噬細胞表型比較

流式細胞術分析結果發現，經治療后，研究組肝臟巨噬細胞中M1 促炎型巨噬細胞（CD45＋F4/80＋CD11B-CD86＋）的占比顯著低于對照組，M2 抑炎型巨噬細胞（CD45＋F4/80＋CD11BCD206＋）的占比顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 2 組肝臟巨噬細胞表型比較 A M1 促炎型巨噬細胞 B M2 抑炎型巨噬細胞

2.3 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

治療前，2 組肝組織中M1 型巨噬細胞標志物（iNOS 和IL-1β）水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。治療后，研究組肝組織中iNOS、IL-1β 水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表1、圖2。

表1 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

圖2 2 組肝組織中iNOS、IL-1β 水平比較

2.4 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

治療前，2 組肝組織中M1 型巨噬細胞標志物（IL-10 和Arg-1）水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。治療后，研究組肝組織中IL-10、Arg-1 水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表2、圖3。

表2 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

圖3 2 組肝組織中IL-10、Arg-1 水平比較

2.5 2 組肝功能指標水平比較

治療前，2 組肝功能指標（包括ALT、AST、TBil 和GGT）水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。治療后，研究組血清ALT、AST、TBil 和GGT 水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 2 組肝功能指標水平比較

2.6 2 組肝纖維化指標水平比較

治療前，2 組肝纖維化指標（ 包括HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C）水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。 治療后， 研究組血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表4。

表4 2 組肝纖維化指標水平比較

2.7 2 組血脂指標水平比較

治療前，2 組血脂指標（TC 和TG）水平的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。治療后，研究組血清TC、TG 水平均顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。見表5。

表5 2 組血脂指標水平比較

3 討論

一項薈萃分析結果顯示，全球50%以上肝臟疾病與過度飲酒有關，其中亞洲地區酒精性肝病的患病率為4.81%，且患病率隨時間推移呈上升趨勢，其可能成為未來亞洲地區慢性肝病的主要原因[11]。研究表明，藥物治療對于酒精性肝病的防治具有一定效果，但其僅能抑制肝纖維化的進展，而無法逆轉早期肝纖維化[12]。肝臟巨噬細胞位于肝血竇內，具有顯著的異質性和極化性，可發揮調節機體免疫應答、清除體內細菌毒素等作用。近年來研究發現，肝臟巨噬細胞極化在肝臟疾病的發生和進展過程中起著重要作用[13]。有報道稱，通過靶向調節肝臟巨噬細胞極化/分化，可減輕由非酒精性脂肪性肝病或酒精性肝病引起的肝臟脂肪變性、炎癥反應、肝纖維化和肝硬化[14]。

PPAR 是糖脂質代謝、炎癥反應等過程的重要調節因子，研究表明PPAR 激動劑在肝病治療中具有重要意義[15]。研究發現，通過激活PPARα 可抑制巨噬細胞向M1 型分化，進而減輕炎癥反應[16]。非諾貝特是一種選擇性PPARα 激動劑。毛重山等[17]研究表明，非諾貝特可有效降低非酒精性脂肪性肝病合并2 型糖尿病患者的血脂水平，并減輕肝纖維化程度。本研究將非諾貝特應用于酒精性肝病患者的治療，結果發現經治療后患者血清TC、TG 水平均顯著降低，與以往的報道相符[17]，這提示非諾貝特可有效改善酒精性肝病患者的血脂水平，其機制可能為非諾貝特通過PPARα 途徑促使膽固醇轉化為膽汁酸流出，并抑制膽固醇從頭合成，從而加速脂肪酸氧化[18]。本研究入組患者的肝纖維化分期為S1～S2 期，屬于早期肝纖維化。研究結果顯示，經非諾貝特治療后患者血清肝功能及肝纖維化指標水平均顯著改善，且與經常規干預治療的對照組相比，上述指標顯著降低，這提示非諾貝特可能具有逆轉早期肝纖維化的作用，并能促進肝功能恢復，這與以往報道結果相符[19]。本研究發現，研究組治療后肝內固有巨噬細胞中CD45＋F4/80＋CD11B－CD86＋細胞的占比顯著低于對照組，CD45＋F4/80＋CD11B－CD206＋細胞的占比顯著高于對照組，這提示非諾貝特可能通過抑制肝臟巨噬細胞向M1 型分化，并促進M1 型向M2 型極化，進而改善肝臟纖維化程度。iNOS 和IL-1β 主要由M1 型巨噬細胞分泌，IL-10 和Arg-1 主要由M2 型巨噬細胞分泌。本研究結果顯示，治療后，研究組肝組織中iNOS、IL-1β 水平均顯著低于對照組，而IL-10、Arg-1 水平均顯著高于對照組，這表明非諾貝特治療酒精性肝病的作用機制可能與促進肝臟巨噬細胞向M2 抑炎型巨噬細胞分化有關。

綜上所述，非諾貝特能夠有效降低酒精性肝病患者的血脂水平，抑制肝纖維化進展，改善肝功能，其作用機制可能與調節肝臟巨噬細胞極化有關。本研究僅納入酒精性肝病伴早期肝纖維化患者，且未對患者的不良反應進行觀察和統計，結果存在一定局限性，擬在今后擴大樣本量進一步探究非諾貝特的應用價值。