血清長鏈非編碼RNA CCAT1 對非酒精性脂肪性肝病患者肝纖維化及其程度的診斷價值

谷娟娟 丁 茹 周曉娜 周昌虎

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球較常見的慢性肝病，其發生和進展與胰島素抵抗及遺傳易感密切相關[1]，其病理特征是除肝臟損傷及乙醇攝入外的因素導致的肝內脂肪過度沉積[2]。研究報道亞洲人群的NAFLD 發病率高達27.4%，且呈逐年升高趨勢，嚴重危害了公共健康[3]。隨著NAFLD 患者的病情進展，肝細胞出現損傷甚至壞死，引起肝細胞增殖及纖維結締組織增生，導致肝纖維化發生，并可進展為肝硬化[4-5]。在西方國家，NAFLD 正成為肝移植最常見的適應證[6]。肝纖維化嚴重程度與NAFLD 患者的預后密切相關，因此早期診斷肝纖維化對于改善預后尤為重要[7]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種相對穩定的遺傳物質，其參與調控基因轉錄等過程。lncRNA 結腸癌相關轉錄因子1 （CCAT1） 最初被視為促癌因子，其在結腸癌組織中呈高表達[8]。近年來研究發現，lncRNA CCAT1（以下簡稱為CCAT1）也參與了卵巢癌、肝細胞癌等惡性腫瘤發生和進展的調控過程[9-10]。目前CCAT1 與NAFLD 關系的相關研究較少見，本研究探討了血清CCAT1 水平對NAFLD 患者肝纖維化及其程度的診斷價值，以期為NAFLD合并肝纖維化患者的診斷及治療提供參考。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年2 月至2021 年12 月在樹蘭（杭州）醫院住院治療的256 例NAFLD 患者作為研究對象，男性143 例，女性113 例，年齡33～70 歲，平均年齡為（52.49±10.33）歲。納入標準：（1）NAFLD 患者的診斷符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》[11]中NAFLD 診斷標準；（2） 經肝臟穿刺活體組織病理檢查判斷纖維化程度； （3）患者知情同意。排除標準： （1）合并肝硬化、病毒性肝炎等其他肝病；（2）有大量飲酒史（女性＞20 g/d，男性＞30 g/d）； （3）合并嚴重心、肺、腎功能不全；（4）合并其他臟器纖維化。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準（審批號2018-1-016）。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 法檢測血清CCAT1 水平 抽取受試者清晨空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心15 min，取血清，使用TRIzol 試劑（購自上海尚寶生物科技有限公司）提取血清中總RNA，按反轉錄試劑盒（購自上海化邦生物科技有限公司）操作步驟反轉錄合成cDNA，使用ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（購自美國ABI 公司）進行檢測。反應條件：95 ℃預變性 8 min；之后95 ℃變性30 s，56.5 ℃退火20 s，72.5 ℃延伸15 s，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因CCAT1 的相對表達量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 肝纖維化程度評估 所有患者均接受肝臟穿刺活體組織病理檢查，采用Metavir 評分系統進行肝纖維化評估[12]。F0 期患者無肝纖維化，將其納入無肝纖維化組（100 例）；F1～F4 期患者存在肝纖維化，將其納入肝纖維化組（156 例）。F1～F2期患者為輕中度肝纖維化，將其納入輕中度肝纖維化組（112 例）；F3～F4 期患者為重度肝纖維化，將其納入重度肝纖維化組（44 例）。

1.2.3 臨床資料收集 收集患者的臨床資料，包括肝功能指標ALT、AST、GGT、總膽固醇（TC）、總膽紅素（TBil），肝纖維化指標——Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA），以及年齡、性別、身高、體重、既往病史，并計算BMI。實驗室檢查指標均由樹蘭 （杭州）醫院檢驗科檢測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計學分析。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。血清CCAT1 與肝纖維化指標的相關性采用Pearson 法分析。采用ROC 曲線分析血清CCAT1 對NAFLD 患者肝纖維化及其程度的診斷效能。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝纖維化組與無肝纖維化組的臨床資料及血清CCAT1 水平比較

肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于無肝纖維化組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。2 組的年齡、性別、BMI、糖尿病患者占比、高血壓患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC 水平差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 無肝纖維化組與肝纖維化組的臨床資料及CCAT1 水平比較

2.2 輕中度肝纖維化組與重度肝纖維化組的臨床資料及血清CCAT1 水平比較

重度肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于輕中度肝纖維化組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。2組的年齡、性別、BMI、糖尿病患者占比、高血壓患者占比、肝病家族史患者占比、TBil 水平和TC水平差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 輕中度肝纖維化組與重度肝纖維化組的臨床資料及CCAT1 水平比較

2.3 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 與肝纖維化指標的相關性分析

Pearson 相關性分析結果顯示，NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 水平與肝纖維化指標血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相關（P均＜0.05）。見表4。

表4 血清CCAT1 與肝纖維化指標的相關性分析

2.4 NAFLD 患者的血清CCAT1 對肝纖維化的診斷效能

以有無肝纖維化為狀態變量（無肝纖維化＝0，肝纖維化＝1），以血清CCAT1 水平為檢驗變量，繪制ROC 曲線，分析結果顯示NAFLD 患者的血清CCAT1 診斷肝纖維化的AUC 為0.742（（95%CI：0.684～0.795），最佳截斷值為1.37，敏感度和特異度分別為55.57%和83.00%。見圖1。

2.5 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 對肝纖維化程度的診斷效能

以肝纖維化程度為狀態變量（輕中度肝纖維化＝0，重度肝纖維化＝1），以血清CCAT1 水平為檢驗變量，繪制ROC 曲線，分析結果顯示NAFLD合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的AUC 為0.795（95%CI：0.723～0.855），最佳截斷值為1.43，敏感度和特異度分別為84.09%和63.39%。見圖2。

圖2 NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的ROC 曲線

3 討論

NAFLD 患者的肝臟組織病理特征是肝細胞內脂肪過度沉積，多數患者無過量飲酒史，是代謝綜合征的肝臟表現[13]。中國的NAFLD 發病率呈逐年升高趨勢，是中國慢性肝病的常見類型[14]。脂肪在肝臟過度堆積可能會促進肝纖維化的發生和進展，部分NAFLD 患者會合并不同程度的肝纖維化。研究發現肝纖維化的發生會使NAFLD 患者死亡風險增高[15]，因此早期診斷肝纖維化及其程度對于提高NAFLD 患者的生存率尤為重要。目前肝臟活體組織病理檢查仍被視為評估肝纖維化及其程度的金標準，但因其為有創性檢查且費用較高，加之其易受醫生主觀因素影響，因此其作為早期診斷肝纖維化及其程度的方法應用受到了限制[16]。血清學指標取材較方便，檢測速度較快，為肝纖維化無創性診斷提供了新的方法。

lncRNA 是目前被研究得較為廣泛的血清學標志物。近年來研究發現，功能性lncRNA 有潛力作為生物標志物。CCAT1 最早在結腸癌組織中被發現，其在多種惡性腫瘤中起著促癌作用。魏旭靜等[17]的研究發現，沉默CCAT1 表達可抑制子宮內膜癌細胞增殖。Cai 等[18]的研究發現，CCAT1 可通過調節miR-490-3p/FRAT1 信號通路促進前列腺癌細胞增殖和遷移。李蘭花[19]的研究發現，HBV 相關肝細胞癌患者的血清外泌體CCAT1 表達水平顯著高于對照組。目前CCAT1 與肝纖維化關系的相關研究報道較少。

研究發現不同lncRNA 在肝纖維化進程中的作用不同，一部分lncRNA 起著促進作用，而另一部分lncRNA 則起著抑制作用，還有少數lncRNA 發揮著雙重作用[20]。本研究結果顯示，在NAFLD 患者中，肝纖維化組的血清CCAT1 水平顯著高于無肝纖維化組，肝功能指標ALT、AST、GGT 和肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA 水平也均顯著高于無肝纖維化組，這提示CCAT1 可能參與調控NAFLD 患者肝纖維化的發生。ROC 曲線分析結果顯示，NAFLD 患者的血清CCAT1 診斷肝纖維化的AUC 為0.742，敏感度和特異度分別為55.57%和83.00%，當血清CCAT1＞1.37 時，提示NAFLD 患者發生肝纖維化的可能性較大；Lu 等[21]的研究發現CCAT1 水平與急性腎損傷小鼠腎纖維化有關，這與本研究結果相似。此外，本研究還發現，重度肝纖維化組的ALT、AST、GGT、PCⅢ、CⅣ、LN、HA 和CCAT1 水平均顯著高于輕中度肝纖維化組，Pearson 相關性分析結果顯示NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 水平與肝纖維化指標血清PCⅢ、CⅣ、LN 水平均呈正相關，上述結果提示CCAT1 可能參與調控NAFLD 患者肝纖維化的進展。ROC 曲線分析結果顯示，NAFLD 合并肝纖維化患者的血清CCAT1 診斷重度肝纖維化的AUC 為0.795，敏感度和特異度分別為84.09%和63.39%，當血清CCAT1 水平＞1.43 時，提示NAFLD 患者合并重度肝纖維化的風險增高。Huang 等[22]的研究結果顯示，CCAT1 在油酸誘導的HepG2 細胞及L02 細胞中表達顯著上調，而沉默CCAT1 表達可抑制細胞中脂滴形成，CCAT1 在NAFLD 臨床樣本中的表達也顯著上調，這與本研究結果一致，提示CCAT1 可能通過促進肝細胞內脂肪沉積促進肝纖維化的發生和進展。

綜上所述，NAFLD 患者中，有肝纖維化患者的血清CCAT1 水平高于無肝纖維化患者，且血清CCAT1 水平隨肝纖維化程度的加重而升高。血清CCAT1 對于NAFLD 患者肝纖維化及其程度的早期診斷具有一定價值。