健脾通絡方調控Wnt/β-catenin 信號通路對結直腸癌肝轉移模型小鼠的影響及機制研究

劉 怡 任建琳 靖 琳 儲金硯 趙 勇 周 霖 吳杏黎

結直腸癌（CRC）居全球惡性腫瘤發病率第3位，2018 年全球每年約有88 萬例CRC 患者死亡[1]。有遠處轉移的CRC 患者的3 年、5 年總生存率（OS）僅為20.7%和10.5%[2]。手術是CRC的首選治療方法，目前靶向治療效果有限，術后5 年生存率并不理想，復發、轉移是影響CRC 患者預后的重要因素，提高CRC 患者生存率和降低病死率是中國CRC 臨床治療面臨的巨大挑戰。研究表明中藥在腫瘤免疫治療方面具有重要價值，其作用包括直接抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及誘導腫瘤細胞凋亡，可通過調節腫瘤微環境（TME）以促進抗腫瘤免疫反應[3]。TME 能誘導腫瘤相關巨噬細胞分化成 M1 型和 M2型巨噬細胞。M1 型巨噬細胞可促進炎癥反應，M2型巨噬細胞可分泌抗炎細胞因子[如轉化生長因子-β（ TGF-β）、IL-10 和IL-13 等]，促進腫瘤細胞增殖和遷移，可導致化學治療耐藥[4]。經典Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路異常激活是CRC發生和進展的關鍵驅動因素[5]。Qi 等[6]的研究發現，Wnt/β-catenin 信號通路參與了腫瘤血管生成擬態（VM）形成，從而促進腫瘤細胞增殖[7]。健脾通絡方是本課題組基于絡病理論治療腫瘤的經驗方，具有通絡散結、健脾扶正抗癌的作用（專利號ZL202010190627.3）[8-9]，前期臨床研究表明健脾通絡方能抑制CRC 遠處轉移、延長患者的生存期，其增效減毒效果顯著[10-12]。本實驗針對Wnt/β-catenin信號通路，探討了健脾通絡方對Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達、CRC 遠處轉移及免疫抑制的影響，以期為CRC 的中醫藥治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物

選取36 只4 周齡雄性SPF 級BALB/c 裸鼠，體重為（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，于SPF 級環境中適應性飼養1 周后造模。本課題所有動物相關研究均遵循上海中醫藥大學的相關動物使用管理條例（倫理批件號2021SHLKY-01-01）。

1.2 細胞

人結腸癌細胞 HCT116 購自中科院上海生命科學研究院細胞庫。細胞株使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、90% RPMI 1640 培養液培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.3 藥物

健脾通絡方組成：天龍3 g、蜈蚣3 g、黃芪30 g、黨參15 g、麩炒白術12 g、白茯苓18 g、炒薏苡仁25 g、苦參15 g、藤梨根15 g、白花蛇舌草15 g、甘草6 g，上述藥物均購自上海中醫藥大學附屬市中醫醫院。將中藥水煎煮至 250～300 mL，合并2 次水提液，用旋轉蒸發儀濃縮至生藥濃度為3.2 g/mL，采用低溫間歇滅菌法，-20 ℃保存備用。在體內實驗中，參考《藥理學實驗方法》[13]中的人和動物體表面積的等效劑量轉換公式，根據體表面積（BSA）歸一化法，小鼠實驗中使用的健脾通絡方劑量（等效臨床劑量）為 3.75 g/kg 。5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液購自天津金耀藥業有限公司（規格10 mL 0.25 g，國藥準字號 H12020959）。

1.4 主要實驗儀器

LS1FD1903028 超凈工作臺購自美國Thermo公司；HWS-250 37 ℃ CO2培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司；CP225D 超純水系統購自德國Sartorious Stedim Biotech 公司；JJ-12J 脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；JB-P5 包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016 病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；IVIV 200 小動物活體成像儀購自美國Xengon 公司。

1.5 動物造模、分組、給藥及觀察

將HCT116 細胞濃度調整為2×106個/mL，采用0.3% 戊巴比妥鈉對小鼠行腹腔麻醉，將其放入超凈臺，用碘伏消毒手術區域，在小鼠左背部作一0.5～1.0 cm 長的斜切口，將脾臟下端輕輕提起，在小鼠脾臟注射0.2 mL HCT116 細胞懸液，注射完畢予輕壓止血，將脾臟復位后關腹。HTC116 細胞被注射入脾臟后，可通過血液循環轉移至肝臟，從而建立CRC 肝轉移小鼠模型。造模成功后，采用隨機數表法將小鼠分為對照組、健脾通絡方組、5-FU組和健脾通絡方＋5-FU 組，每組 9 只 。

健脾通絡方組采用灌胃給藥，3.75 g/kg，對照組給予同體積0.9% NaCl 溶液灌胃，每日1 次；5-FU組采用腹腔注射給藥，0.025 g/kg，隔日1 次；健脾通絡方＋5-FU 組為聯合給藥；各組均治療28 d。對應給藥后觀察各組的一般情況（包括精神狀態、活動度等），分別在第1、7、14、21、28 天稱量體重。末次給藥后小鼠予禁食不禁水12 h，用0.3%戊巴比妥鈉麻醉，使用小動物活體成像儀觀察各組的肝轉移情況；摘除眼球取血并收集肝臟組織，分別置于滅菌細胞管中，放入液氮凍存備用。

1.6 ELISA 法檢測

將小鼠血液樣本放入EP 管內，在4 ℃下以3 000 r/min 離心20 min，吸取上清液，采用ELISA法檢測血清中相關因子表達水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 免疫組織化學染色法和H-E 染色法分析

肝組織經固定、脫水、透明、浸蠟、切片、脫蠟，將包埋的組織切片進行免疫組織化學染色，用光學顯微鏡觀察各組腫瘤轉移情況。

將H-E 染色后的肝組織加入3% H2O2，室溫下孵育阻斷，加入一抗和相應的二抗。用DAB 液顯色，用H-E 染色細胞核，封片，用光學顯微鏡觀察肝組織中相關蛋白表達情況。

1.8 統計學分析

應用SPSS 26. 0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，實驗均重復3 次。根據數據的正態分布和方差齊性檢驗結果選擇合適的檢驗方法，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組的體重比較

36 只小鼠均造模成功，未發生死亡。在給藥第1 天，各組的活動度、飲食和飲水、排尿和排便，以及體重均無明顯差異。隨著給藥時間延長，各組的體重均呈增加趨勢。在給藥第21、28 天，健脾通絡方組、5-FU 組和健脾通絡方＋5-FU 組的體重均較對照組顯著降低（P均＜0.05），提示3 組的體重增加趨勢均較對照組顯著減緩。見表1。

表1 各組的體重比較

2.2 各組的血清TGF-β、IL-10 表達水平比較

與對照組相比，其余3 組的血清TGF-β、IL-10表達水平均顯著降低（P均＜0.001）。見表2。

表2 各組的血清TGF-β、IL-10 表達水平比較

2.3 健脾通絡方對CRC 小鼠肝轉移的影響

小動物活體成像顯示，與對照組相比，其余3組的肝區熒光光子數均顯著減少（P均＜0.01），這提示3 組的肝轉移情況均較對照組顯著減輕。見圖1、圖2。

圖1 小動物活體成像觀察各組CRC 小鼠肝轉移情況

圖2 各組的熒光光子數比較

2.4 各組的肝組織病理學變化

各組的肝組織中均可觀察到轉移灶形成。對照組的肝細胞結構呈明顯皺縮，肝組織見大量腫瘤細胞通過血管轉移，血管周圍多見腫瘤細胞對肝組織浸潤，其余3 組的肝轉移灶均減少，健脾通絡方＋5-FU 組的肝組織結構較完整，轉移灶最少且體積較小。見圖3。

圖3 各組的肝組織病理學改變 H-E 染色 ×100 A 對照組 B 健脾通絡方組 C 5-FU 組 D 健脾通絡方＋5-FU 組

2.5 各組的肝組織中相關蛋白表達水平比較

Wnt3a 和β-catenin 主要表達在細胞質，Ki-67主要表達在細胞核，免疫組織化學染色陽性表達為細胞質或細胞核呈棕色。結果顯示，與對照組相比，其余3 組的肝組織中Wnt3a、β-catenin 和Ki-67蛋白陽性表達率均顯著降低（P均＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 各組的肝組織中相關蛋白表達情況比較 免疫組織化學染色 ×100

圖5 各組的相關蛋白陽性表達率比較

3 討論

先秦時期中醫就對CRC 有一定的認識，雖無具體病名，但有類似記載，如“腸覃”、“臟毒”、“鎖肛痔”等[14]。《靈樞·水脹》中記載：“腸覃者，寒氣客于腸外，與衛氣相搏，氣不得榮，因有所系，癖而內著，惡氣乃起，息肉乃生。其始生也，大如雞卵，稍以益大，至其成，如懷子之狀，久則離歲，按之則堅，推之則移，月事以時下，此其候也。”其發生多由于正氣虧虛，氣血運行不暢，水飲停留，絡脈血運遲緩，甚則氣滯血停，痰濕凝聚，絡脈受阻則精微不布。CRC 發病較隱匿、病程較長，符合中醫“久病入絡”病機。清代葉天士提出“久病入絡”、 “久痛入絡”，使“絡病”成為內傷疑難雜癥病機概念，在臨床實踐中提高了對腫瘤等多種難治性疾病的臨床療效。絡脈作為經脈的網絡分支遍布全身，其具有運行氣血、滲濡灌注的作用，絡脈的功能及形態結構與現代微循環系統十分相似[8]。單純的正氣虧虛或一般的外邪侵襲等尚不足以導致CRC，當代醫家在古人思想上提出“癌毒”，這是導致惡性腫瘤的重要因素，它隨著絡脈循行，遍及全身，終致不治[8]。根據蟲藥搜經通絡，擅行氣血的特點，臨床多用蟲藥配伍扶正類中藥治療絡脈不通、絡脈受損等疑難雜癥。本課題組對CRC門診治療用藥進行聚類分析，結合任建琳教授多年臨床治療CRC 經驗總結，形成健脾通絡方，并成功申報“疑難疾病精準診治攻關”項目，對含蟲藥的健脾復方顆粒治療CRC 的療效及影響因素進行多中心臨床研究[15]。健脾通絡方中天龍、蜈蚣性善走竄，搜剔絡中瘀血、散結攻毒、推陳致新；藤梨根、白花蛇舌草清熱解毒以散結消瘤；黃芪、黨參補中益氣；白術、茯苓健脾益氣以資后天之本；苦參清熱燥濕，薏苡仁利水滲濕；甘草解毒調和諸藥。健脾通絡方全方共奏通絡散結、健脾扶正、抗癌消瘤之功，通過絡虛通補、蟲藥通絡、藤藥通絡體現“絡以通為用”的治療原則。

經典Wnt/β-catenin 信號通路被認為對于維持細胞內穩態和胚胎發育至關重要，研究表明其與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和化學治療耐藥有關[16]。Wnt/β-catenin 信號通路異常激活是CRC 進展的重要因素，β-catenin 是其關鍵調節因子。未磷酸化或失活的β-catenin 在細胞質中累積，并可進入細胞核結合T 細胞因子，激活與細胞增殖、細胞周期和惡變相關的下游靶蛋白[17-18]。免疫相關細胞因子表達變化能通過影響腫瘤微環境抑制腫瘤進展。研究表明TGF-β 參與了早期胚胎發育和器官發生、免疫監督、組織修復和維持體內穩態，在腫瘤中的作用是復雜的，根據疾病階段可發揮抑制或促進作用[19]。研究發現TGF-β 過度表達可導致代謝紊亂和細胞功能障礙，并可促進上皮間質轉化（EMT）和細胞外基質過度沉積[20-21]。在腫瘤早期階段，TGF-β 可抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，發揮抑癌作用[22]，而在腫瘤晚期階段，腫瘤細胞可對其抗有絲分裂作用產生抗性，而TGF-β 則可轉變為促癌因子，TGF-β 信號轉導可通過上調間充質標志物表達及下調上皮標志物的表達以促進EMT[23-24]。CRC 的特征為先天免疫細胞、成纖維細胞和TGF-β激活的高基質浸潤[25]。TGF-β 參與調節CRC 轉移、腫瘤基質、微環境和免疫系統抵抗。研究表明TGF-β 可通過調節Wnt/β-catenin 信號通路介導多種疾病的發生和進展[26-27]。IL-10 在腫瘤發生與機體免疫系統中也發揮著重要作用，研究發現IL-10可抑制機體對腫瘤細胞的免疫應答，并可促進腫瘤細胞發生免疫逃逸[28]。Liu 等[29]的研究表明，IL-10 可誘導M2 型巨噬細胞介導Wnt 通路以促進腫瘤的發生和進展。

本研究結果顯示，采用健脾通絡方干預CRC肝轉移小鼠后，其體重增加趨勢較對照組顯著減緩。小動物活體成像、H-E 染色結果顯示，健脾通絡方干預后小鼠肝轉移進展較對照組顯著減緩。ELISA法和免疫組織化學染色法結果顯示，健脾通絡方能下調CRC 肝轉移小鼠的血清TGF-β、IL-10 表達水平，減輕免疫抑制，抑制Wnt/β-catenin 通路信號相關蛋白的表達，從而抑制CRC 細胞轉移。