芒柄花素調節HIF-1α/VEGF 信號通路對胃癌細胞增殖、凋亡和腫瘤血管生成擬態的影響

韓 輪 馬艷飛

胃癌是全球范圍內常見的消化系統惡性腫瘤。流行病學研究報道，胃癌發病率隨著年齡增長而逐漸升高，分別居男、女惡性腫瘤發病率第2、第3 位[1]。雖然近年來胃癌的手術、放射治療和化學治療等方面均取得了一定的進展，但由于手術切除率較低、化學治療的不良反應較嚴重且復發率較高，因此胃癌患者的病死率并未顯著降低[2]，亟需探索新的治療胃癌的有效方法。研究表明芒柄花素（FMN）在某些惡性腫瘤（如結腸癌、乳腺癌）中表現出抑癌活性，FMN 在胃癌中也表現出一定的抑癌活性[3]。血管生成擬態（VM）在腫瘤生長和轉移中起著重要作用，如胃癌中存在明顯的VM 形成，因此探索VM 對于抑制腫瘤惡性生物學行為具有重要意義[4-5]。腫瘤細胞通過低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達和轉錄誘導多種促血管生成因子[如血管內皮生長因子（VEGF）]，并且VEGF 可通過調節多種血管生成因子的表達為腫瘤血管生成提供有利環境，VEGF 與其受體（VEGFR）結合可促進腫瘤細胞增殖、遷移和腫瘤血管形成，因此抑制HIF-1α/VEGF 信號通路可阻止腫瘤血管生成和腫瘤進展[6-7]。本研究探討了FMN 調節HIF-1α/VEGF 信號通路對胃癌細胞增殖、凋亡和腫瘤VM 形成的影響，以期為胃癌患者的臨床治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株BGC-823、MGC-803、MKN28 和SGC-790 均購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所；人胃黏膜上皮細胞株GES-1 購自美國典型菌種保藏中心（ATCC）。所有細胞株均在RPMI 1640 培養基（含2.5%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清） 中并置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，2～3 d更換培養基，進行常規傳代培養。

FMN 購自北京恒業中遠化工有限公司；HIF-1α過表達質粒 （pc-HIF-1α） 及其陰性對照（pc-vector）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RAPI 裂解液、MTT 試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自美國BD 公司；TRIzol 試劑購自美國Ambion 公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo 公司；SYBR 試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；抗HIF-1α、VEGF 一抗均購自英國Abcam 公司；SpectraMax M4 酶標儀購自美國MD 公司；Guava easyCyte HT 流式細胞儀購自美國Millipore 公司。

1.2 實時熒光定量PCR 法檢測各細胞株中HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平

使用TRIzol 試劑提取胃癌細胞株（BGC-823、MGC-803、MKN28 和SGC-790）及胃黏膜上皮細胞株GES-1 中總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，使用SYBR 試劑進行實時熒光定量PCR 檢測。PCR 反應條件：94 ℃變性45 s、59 ℃退火45 s 和72 ℃延伸7 min，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用2-△△Ct法計算HIF-1α、VEGF的mRNA 相對表達量。引物由生工生物科技 （上海）有限責任公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 MGC-803 細胞分組及處理

取對數生長期的MGC-803 細胞，分別以30、50、80 μmol/L FMN 處理MGC-803 細胞，對應設為30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組、80 μmol/L FMN 組[3]；此外，MGC-803 細胞在80 μmol/L FMN處理的基礎上分別轉染pc-HIF-1α、pc-vector，對應設為80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組、80 μmol/L FMN＋pc-vector 組；另將未經處理的MGC-803 細胞設為對照組。24 h 后分析各指標變化。

1.4 MTT 法檢測各組MGC-803 細胞增殖情況

取對數生長期MGC-803 細胞接種于96 孔板中（每孔5×103個細胞），每組6 個重復，按照上述分組處理后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）孵育4 h，之后1 000 r/min 離心10 min，棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO 輕輕搖動10 min。使用酶標儀讀取570 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞增殖率（即細胞活力）。

1.5 流式細胞儀檢測各組MGC-803 細胞凋亡情況

收集對數生長期MGC-803 細胞，用PBS 洗滌3 次，以1 500 r/min 離心15 min。去除上清液后，用200 μL PBS 重懸細胞，然后以10 μL AnnexinVFITC 和5 μL PI 對細胞進行雙重染色，細胞避光孵育15 min，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.6 實時熒光定量PCR 法檢測各組MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平

操作步驟與1.2 相同。

1.7 成管實驗檢測VM 形成情況

收集對數生長期MGC-803 細胞，用胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液（密度為1.5×106個/mL），以100 μL/ 孔接種至96 孔板中， 孔底預先用Matrige 基質膠覆蓋，然后按照1.3 方法分組處理細胞，24 h 后在顯微鏡下拍照觀察VM 形成情況，每孔隨機選取5 個視野進行管樣結構計數，其中形成完整封閉結構計為1 個管樣結構。

1.8 蛋白質印跡法檢測各組MGC-803 細胞中HIF-1α、p-VEGF、VEGF 的蛋白表達水平

用RAPI 裂解液裂解MGC-803 細胞總蛋白，在4 ℃下以14 000 r/min 離心30 min，取上清液并檢測蛋白質濃度，分離蛋白質，通過濕轉法轉移至PVDF 膜上，將膜用脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗在4 ℃下孵育過夜，然后加入相應二抗在室溫下孵育1 h。以GAPDH 為內參，應用ImageJ 軟件定量分析HIF-1α、p-VEGF 和VEGF 的蛋白表達水平。

1.9 統計學分析

應用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各細胞株中HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平比較

與人胃黏膜上皮細胞株GES-1 相比，胃癌細胞株（BGC-823、MGC-803、MKN28 和SGC-790）中HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平均顯著升高 （P均＜0.05），其中MGC-803 細胞的變化最顯著，故將其作為后續研究對象。見表2。

表2 各細胞株中HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平比較

2.2 FMN 對各組MGC-803 細胞增殖率的影響

與對照組相比，30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組、80 μmol/L FMN 組細胞增殖率均顯著降低，并呈劑量依賴性（P均＜0.05）；與80 μmol/L FMN＋pc-vector 組相比，80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組MGC-803 細胞增殖率比較

2.3 FMN 對各組MGC-803 細胞凋亡率的影響

與對照組相比，30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組、80 μmol/L FMN 組細胞凋亡率均顯著升高，并呈劑量依賴性（P均＜0.05）；與80 μmol/L FMN＋pc-vector 組相比，80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 各組MGC-803細胞的凋亡情況 A 對照組 B 30 μmol/L FMN組 C 50 μmol/L FMN組 D 80 μmol/L FMN組 E 80 μmol/LFMN＋pc-vector 組 F 80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組

表4 各組MGC-803 細胞凋亡率比較

2.4 FMN 對各組MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平的影響

與對照組相比，30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組、80 μmol/L FMN 組細胞中HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平均顯著降低，并呈劑量依賴性（P均＜0.05）；與80 μmol/L FMN＋pc-vector 組相比，80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組細胞中HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平均顯著升高（P均＜0.05）。見表5。

表5 各組MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF 的mRNA 表達水平比較

2.5 FMN 對各組MGC-803 細胞VM 的影響

成管實驗結果顯示，對照組管樣結構良好，而30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組和80 μmol/L FMN 組細胞管樣結構形成被不同程度損壞，3 組細胞管樣結構數目較對照組均顯著減少，并呈劑量依賴性（P均＜0.05）；與80 μmol/L FMN＋pcvector 組相比，80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組細胞管樣結構形成得到改善，管樣結構數目顯著增加（P＜0.05）。見表6、圖2。

圖2 觀察MGC-803 細胞管樣結構形成 ×100 A 對照組 B 30 μmol/L FMN 組 C 50 μmol/L FMN 組 D 80 μmol/L FMN 組E 80 μmol/L FMN＋pc-vector 組 F 80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組

表6 各組MGC-803 細胞管樣結構數目比較

2.6 FMN 對MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF 的蛋白表達水平的影響

與對照組相比，30 μmol/L FMN 組、50 μmol/L FMN 組、80 μmol/L FMN 組細胞中HIF-1α、VEGF的蛋白表達水平均顯著降低，并呈劑量依賴性（P均＜0.05）；與80 μmol/L FMN＋pc-vector 組相比，80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α 組細胞中HIF-1α、VEGF 的蛋白表達水平均顯著升高（P均＜0.05），見表7、圖3。

圖3 各組MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF 的蛋白表達水平

表7 各組MGC-803 細胞中HIF-1α、VEGF 的蛋白表達水平比較

3 討論

研究報道胃癌居全球惡性腫瘤病死率第3 位，胃癌患者的5 年生存率低于5%[8]。目前手術、放射治療及化學治療是胃癌的主要治療方法，雖可延長生命，但對中、晚期胃癌患者的療效并不理想[9]。因此，深入探究胃癌的發病機制對于研發高效的胃癌治療藥物具有重要意義。

FMN 為黃酮類衍生物，其在人類腫瘤細胞的凋亡、遷移和腫瘤血管生成等方面表現出顯著的抑癌作用[10-11]。趙玉民等[12]的研究發現，FMN 在宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌及膀胱癌等腫瘤中發揮著抑癌作用，可通過多種途徑抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為。此外，FMN 衍生物可抑制人胃癌細胞株SGC7901 的增殖和遷移，體內實驗表明FMN 衍生物可有效抑制SGC7901 細胞異種移植腫瘤的生長，具有治療胃癌的臨床應用前景[13]。Wang 等[3]的研究發現，FMN 可減弱人胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803 的增殖、遷移和侵襲能力，提示FMN具有抑癌作用。本研究結果顯示，分別使用30、50、80 μmol/L FMN 處理人胃癌細胞株MGC-803 后，細胞增殖均被顯著抑制，細胞凋亡率顯著升高，并呈劑量依賴性，提示FMN 可顯著抑制MGC-803 細胞的惡性生物學行為，具有一定的抑癌作用。

血管生成為實體腫瘤的生長、轉移和進展提供了氧氣、營養和生長因子，因此靶向血管生成被認為是有效治療腫瘤的關鍵。腫瘤血管生成通常由腫瘤細胞分泌的各種促血管生成因子誘發，而VEGF是較有效的血管生成誘導劑，并可與VEGFR1、VEGFR2 和VEGFR3 相互作用[14]。研究表明，HIF-1α 是調節VEGF 產生的主要因子，而HIF-1α 在腫瘤微環境中被認為是缺氧細胞常用的轉錄因子，其可激活包括VEGF在內的多種腫瘤存活和進展相關的下游基因轉錄[15-16]。本研究發現人胃癌細胞株（BGC-823、MGC-803、MKN28 和SGC-7901）中HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平均較人胃黏膜上皮細胞株GES-1 顯著升高，提示胃癌進展與HIF-1α/VEGF 信號通路被激活有關。林培敏等[17]的研究發現，丙泊酚可通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路抑制間歇性缺氧乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。孫憲春等[18]的研究發現，腫瘤轉移相關蛋白1 可激活HIF-1α/VEGF 信號通路，從而促進胰腺癌細胞增殖和遷移。本研究發現，分別使用30、50、80 μmol/L FMN 處理MGC-803 細胞后，管樣結構的形成被不同程度損壞，管樣結構數目均顯著減少，該結果表明FMN 抑制胃癌的VM 形成可能與HIF-1α/VEGF 信號通路被抑制有關，這與Han 等[19]的研究結果一致。本研究進一步對MGC-803 細胞在80 μmol/L FMN 處理的基礎上分別轉染pc-HIF-1α、pc-vector，分析結果顯示80 μmol/L FMN＋pc-HIF-1α組細胞的管樣結構形成得到改善，管樣結構數目顯著增加、細胞凋亡率顯著降低，細胞增殖率升高，HIF-1α、VEGF的mRNA 表達水平均上調，表明FMN 可通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路阻止MGC-803 細胞增殖和VM 形成，并誘導其凋亡。

綜上所述，FMN 可抑制胃癌MGC-803 細胞增殖和VM 形成，并誘導其凋亡，這可能是通過抑制HIF-1α/VEGF 信號通路引發的。本研究僅進行了體外實驗，今后將進行動物實驗以驗證本研究結論。