乙型肝炎病毒感染與肝細胞癌血管生成及侵襲轉移的相關性*

才袁 劉洵祺 李國軍 胡曼莉 黃湘榮

(深圳市第三人民醫院,深圳 龍崗 518000)

肝細胞癌是由肝細胞發生的惡性腫瘤。其發病率在全球惡性腫瘤中排名第五,死亡率僅次于肺癌。中國是肝癌發病率最高的國家之一。肝癌的早期發病具有隱蔽性,癥狀并不明顯。在診斷時,大多數患者處于中晚期,錯過最佳治療時間,使得大多數患者在肝癌診斷后約1年內死亡[1-2]。肝細胞癌血管生成與侵襲轉移是患者病情加重的主要特征,與正常組織相類似,腫瘤組織也需要足夠的營養從而維持腫瘤的生長及轉移[3-4]。肝細胞癌的發病機制較為復雜,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus ,HBV)、丙型肝炎病毒感染以及非酒精性脂肪肝炎等均為肝癌發生的因素,其中,HBV感染為肝細胞癌的主要致病因素,據相關統計,我國有超過80%的肝細胞癌患者伴有HBV感染[5]。但關于HBV感染與肝細胞癌血管生成及侵襲轉移的相關關系尚不明確。本研究通過觀察HBV感染及未感染患者VEGF、CD34表達及微血管密度水平,分析VEGF表達與微血管密度的關系及HBV感染情況與患者臨床病理特征的關系,探討HBV與肝細胞癌血管生成及侵襲轉移的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月—2020年11月本院收治的75例肝細胞癌患者作為研究對象,根據患者是否合并HBV感染分為感染組(n=44)及未感染組(n=31)。納入標準:①均符合肝細胞癌的相關診斷及治療指南[6],且經病理學檢查確診。②入院前未接受相關治療。③一般情況良好,無明顯的心、肺、腎等重要臟器器質性病變。④無肝外轉移灶。⑤患者及家屬均知情同意并簽訂知情同意書。排除標準:①病歷資料不全或中途退出者。②合并其他惡性腫瘤疾病。③自身免疫性疾病、嚴重心肝腎功能衰竭者。④妊娠及哺乳期婦女。本研究通過醫院倫理委員會審核批準,均符合醫學倫理學相關原則。

1.2 免疫組化法檢測 以CD34標記血管生成情況,采用免疫組化法[7]測定血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、CD34表達水平。患者給予全麻,經腹腔鏡手術獲取患者肝細胞癌組織及癌旁正常組織,使用福爾馬林溶液進行固定,常規制作石蠟切片,取石蠟切片,將其經二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,蒸餾水清洗,滴加3%過氧化氫去離子水,在室溫下孵育5 min,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入枸櫞酸鈉緩沖液進行水浴修復,自然冷卻,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入一抗,在37 ℃濕盒孵育2 h,磷酸鹽緩沖液沖洗,加入二抗,37 ℃濕盒孵育2 h,磷酸鹽緩沖液沖洗,滴加DAB顯色液,在室溫下顯色,蘇木素復染,鹽酸酒精分化,氨水返藍,烘干并中性樹膠封片。以染色黃色、棕黃色視為陽性表達。

1.3 觀察指標 ①收集患者臨床基本資料,包括年齡(<55歲、≥55歲)、性別(男、女)、HBeAg表達(陽性、陰性)、甲胎蛋白(<20 μg/L、≥20 μg/L)、腫瘤直徑(<4 cm、≥4 cm)、臨床分期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)、包膜浸潤(無、有)、Edmondson分級[8](Ⅰ級+Ⅱ級、Ⅲ級+Ⅳ級)、侵襲轉移(低轉移、高轉移)、術后復發轉移率(低、高)等。②兩組VEGF、CD34、微血管密度水平對比。③分析VEGF表達與微血管密度的關系。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析,患者臨床病理特征等計數資料以率(%)表示,采用2檢驗;微血管密度等計量資料數據均以均數±標準差表示,采用t檢驗;采用2檢驗和Fisher確切概率法[9]分析HBV感染與肝細胞癌患者臨床病理特征的相關性;采用Kaplan-Meier生存曲線[10]分析肝細胞癌組織HBV感染與肝細胞癌患者生存預后的關系。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌患者臨床資料分析 75例肝細胞癌患者中年齡<55歲、≥55歲分別占57.33%(43例)、42.67%(32例);男性、女性分別占77.33%(58例)、22.67%(17例);HBeAg表達陽性、陰性患者分別占25.33%(19例)、74.67%(56例);甲胎蛋白<20 μg/L、≥20 μg/L分別占32.00%(24例)、68.00%(51例);腫瘤直徑<4 cm、≥4 cm分別占21.33%(16例)、78.67%(59例);臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分別占21.33%(16例)、54.67%(41例)、24.00%(18例);包膜浸潤者占56.00%(42例);Edmondson分級中Ⅰ級+Ⅱ級、Ⅲ級+Ⅳ級分別占13.33%(10例)、86.67%(65例);侵襲轉移者中低轉移、高轉移分別占58.67%(44例)、41.33%(31例),術后低、高復發轉移率分別為53.33%(40例)、46.67%(35例)。

2.2 兩組VEGF、CD34、微血管密度水平對比 HBV感染組與未感染組患者VEGF、CD34、微血管密度水平對比差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 肝癌組織中VEGF、CD34表達(400×)

表1 兩組VEGF、CD34、微血管密度水平對比[n(×10-2)]

2.3 VEGF表達與微血管密度的關系 與VEGF表達陰性組對比,VEGF表達陽性組微血管密度水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 VEGF表達與微血管密度的關系

2.4 HBV感染情況與臨床病理特征的關系 兩組患者在年齡、性別、甲胎蛋白、腫瘤直徑方面比較差異無統計學意義(P>0.05);在不同HBeAg表達、TNM分期、包膜浸潤、Edmondson分級、侵襲轉移及術后復發轉移率方面比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 HBV感染情況與臨床病理特征的關系[n(×10-2)]

2.5 HBV感染與肝細胞癌患者生存預后的關系 采用Kaplan-Meier生存曲線分析,HBV未感染患者生存期明顯長于HBV感染患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 HBV感染與肝細胞癌患者生存預后的關系

3 討論

肝細胞癌作為肝癌中最常見的一種,其惡性程度較高,且其發病較為隱匿,隨著醫學科技的進步,各種治療方法的不斷改進,但患者的死亡率仍居高不下[11]。侵襲及遷移被認為是影響肝癌預后的重要因素,也是阻礙療效提高的主要障礙[12]。肝細胞癌的發病機制較為復雜,其發生、發展可能受多基因、多種因素調控,相關因子的異常表達均有可能引起肝細胞癌細胞功能性的改變[13]。HBV感染引起的肝細胞癌作為臨床上最常見的肝細胞癌類型,其可能造成肝功能衰竭及肝硬化等的發生[14]。因此,注重HBV感染的防治工作,重視HBV感染對肝細胞癌的發病及患者預后的影響具有重要意義。

HBV感染引起肝癌的主要原因是HBV侵入肝細胞,然后在肝細胞內沉積和復制,進一步抑制免疫復合物的形成,并沉積在肝臟中激活補體。相關資料顯示[15-16],HBV為原發性肝癌的主要病因,HBV X基因可激活多種癌基因、抑癌基因的轉錄,參與肝細胞的惡性轉化。HBV X在HBV感染的肝癌細胞中可通過上調血管生成因子進一步影響肝癌細胞生物學行為,因此HBV在腫瘤形成過程中可加速血管生成。隨著研究的不斷深入,有學者研究發現[17],肝細胞癌患者的血管生成、侵襲和轉移可能是肝微血管轉移和擴散的重要途徑,進而導致肝腫瘤細胞的肝內轉移。肝細胞癌的血管生成、侵襲和轉移可能是影響患者預后的重要因素[18]。VEGF被認為是目前最重要的血管促成因子,是腫瘤血管形成因子的研究熱點。眾多研究發現[19-20],VEGF在肝細胞癌中呈現高表達水平,并與癌細胞增殖、轉移及復發密切相關。CD34作為一種跨膜磷酸糖蛋白,主要在內皮細胞的遷移及黏附作用中扮演著重要角色,其主要在新生血管內皮細胞中陽性表達。CD34的陽性表達標志著新生血管的生成[21]。HBV中X基因可增強轉錄子活動,進而誘導VEGF等低氧反應表達因子表達[22]。因此HBV在癌細胞形成過程中可促進血管生成。

本研究結果中通過分析HBV感染組與未感染組VEGF、CD34、微血管密度水平變化,結果發現,HBV感染組與未感染組患者VEGF、CD34、微血管密度水平對比差異明顯。與VEGF表達陰性組對比,VEGF表達陽性組微血管密度水平明顯升高,表明HBV感染可上調肝細胞癌中VEGF高表達,促進腫瘤組織中血管形成,并促進癌細胞的侵襲轉移;證實了HBV感染與VEGF、CD34、微血管密度存在相關性,有助于揭示HBV感染導致肝細胞癌發生與發展的機制;同時HBV感染肝細胞癌中VEGF表達升高也說明肝癌細胞容易發生肝內和遠處轉移的特性。通過分析HBV感染與臨床病理特征發現,HBV感染與未感染患者在不同HBeAg表達、臨床分期、包膜浸潤、Edmondson分級及侵襲轉移及術后復發轉移率方面比較具有明顯差異,進而推測肝細胞癌的惡性特征與HBV感染有關。此外,本研究中采用Kaplan-Meier生存曲線通過分析HBV感染與肝細胞癌患者生存預后的關系,結果發現,HBV未感染患者生存期明顯長于HBV感染患者,由此可見HBV感染不僅可影響肝癌細胞血管生成及侵襲轉移,并進一步影響肝細胞癌患者預后生存情況。

4 結論

HBV感染可能通過上凋VEGF、CD34表達,促進腫瘤血管的生存,進而促進肝細胞癌的生長、浸潤和轉移,縮短患者生存期,為探討HBV感染與未感染型肝細胞癌的臨床表現和轉歸以及探索治療方法提供了啟示和方法。