慢性活動性EBV感染患者外周血淋巴細胞表達水平及預后危險因素分析*

張葉萌 張瑩 張延霞

(東營市人民醫院1.輸血科;2.檢驗科,山東 東營 257000)

EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)是人類已知的皰疹病毒之一,其世界范圍內感染率超過90%[1]。研究表明,EBV的原發感染多為急性感染,患者可無典型臨床癥狀或進展為傳染性單核細胞增多癥(Infectious mononucleosis,IM)[2-3]。部分無明顯免疫缺陷的患者,在感染EBV后,可表現為病毒持續活動性的復制,而不進入潛伏感染狀態,或者在進入潛伏感染狀態后病毒再次大量復制,促使患者IM癥狀反復出現,并導致間質性肺炎、噬血細胞綜合征、彌漫性血管內凝血等并發癥的發生,同時伴有EBV抗體異常改變及病毒載量顯著上升,臨床將這一階段稱為慢性活動性EBV(Chronic active Epstein-Barr virus infection,CAEBV)感染[4]。CAEBV的發病機制目前尚待明確,研究認為可能與患者免疫功能異常密切相關[5]。既往關于CAEBV的診療無統一金標準,臨床上主要采用血清學特異性抗體檢測、血清EBV-DNA定量檢測等方式,但均存在一定不足,因此探討其生物學指標表達水平及影響預后的危險因素具有十分重要的臨床意義[6-9]。研究發現,EBV可通過感染T淋巴細胞、自然殺傷細胞、B淋巴細胞等導致機體的免疫機制出現紊亂,故本研究認為外周血淋巴細胞表達水平在一定程度上可反映CAEBV患者的病情[10-11]。基于此,本研究通過探討CAEBV感染患者外周血淋巴細胞表達水平及影響預后的危險因素,旨在為臨床診治CAEBV提供相關依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2021年1月我院收治的64例CAEBV患者為CAEBV組,同期64例IM患者為IM組,64例體檢健康人群為對照組。本研究通過醫院倫理委員會批準(審批號:2016023)。

1.2 診斷標準及納入、排除標準 IM診斷標準為[12]:①出現急性發熱、咽峽炎、肝脾大、淋巴結腫大等臨床癥狀。②血象結果顯示淋巴細胞比例上升(>50%),異型淋巴細胞比例上升(>10%)。③EBV衣殼抗原抗體陽性或外周血EBV DNA檢測陽性。④排除HIV、CMV等病毒感染。CAEBV患者符合2005年Okano等制定的相關標準[12]:①患者表現為持續性或者復發性IM癥狀。②早期抗原以及EBV衣殼抗原抗體上升或外周血EBV DNA水平上升。③慢性病程無法用其他已知疾病解釋。納入標準:①IM組符合IM診斷標準,CAEBV組符合CAEBV診斷標準,對照組為近1個月內體檢健康者。②研究對象及其家屬知情且簽署知情同意書。③未合并其他嚴重疾病者。排除標準:①合并心肌炎、血小板減少癥、肝炎等疾病者。②近3個月內服用糖皮質激素或使用免疫抑制劑者。③合并感染性、免疫系統等其他嚴重疾病者。④依從性差者。

1.3 方法 ①所有研究對象均于入組時(IM組及CAEBV組為未接受治療前)抽取靜脈血5 mL×3管,采用乙二胺四乙酸抗凝。②一管采用全自動血細胞分析儀( XN 2000,日本希森美康)檢測白細胞計數、淋巴細胞計數。③一管采用流式細胞儀(EPICS-XL型,美國Beckman公司)檢測CD3+(抗體克隆號:RM-11)、CD4+(抗體克隆號:RM-11)、CD8+(抗體克隆號:RM-17)、CD4+/CD8+(抗體克隆號:RM-22)、CD4+CD28+(抗體克隆號:RM-31)、CD8+CD28+(抗體克隆號:RM-19)、CD4+CD25+(抗體克隆號:RM-47)、DR+CD8+(抗體克隆號:RM-42)、CD38+CD8+(抗體克隆號:RM-47)、初始CD4+CD62L+CD45RA+(抗體克隆號:RM-18)、初始CD8+CD62L+CD45RA+(抗體克隆號:RM-26)、效應記憶CD4+CD62L-CD45RO+(抗體克隆號:RM-23)、效應記憶CD8+CD62L-CD45RO+(抗體克隆號:RM-54)、NK細胞、B細胞水平。各檢測管中加入10 μL待檢測指標FITC標記的單克隆抗體,并加入100 μL全血,振蕩混勻后,室溫孵育,洗滌,調節并校正流式細胞儀光路和液路,確定變異系數值<2%,設立熒光染色陰陽分界線,每管讀取5000個細胞進行標本檢測,根據各類細胞FoxP3表達情況設置門邏輯,計算各類細胞相對表達比例。每組實驗重復3次。所有淋巴細胞單克隆抗體均購于美國eBioscience公司。④一管采用熒光定量PCR法檢測DNA水平,采用DNA提取試劑盒提取外周血淋巴細胞EBV DNA,通過EBV檢測試劑盒進行熒光定量PCR反應(TC100 PCR儀,Bio-Rad公司,美國),檢測下限為500拷貝/mL,反應體系為:95 ℃ 預變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環35次。每組實驗重復3次。試劑盒均購于德國Simga公司,所有試驗嚴格按照質量管理標準操作規程進行。⑤對CAEBV組患者隨訪1年,記錄患者存活狀態。并根據是否存活分為存活組(n=49)和死亡組(n=15)。

1.4 觀察指標

1.4.1 主要指標:①比較3組CD3+、CD4+、CD8+水平。②比較3組T細胞功能亞群、調節亞群及激活亞群水平(CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+)。③比較3組CD4+和CD8+初始T細胞、記憶T細胞亞群水平。

1.4.2 次要指標:①比較3組白細胞計數、淋巴細胞計數水平、外周血NK細胞、B細胞水平。②對CAEBV患者進行隨訪,根據患者結局分為存活組和死亡組,收集兩組一般資料,包括年齡、性別、白細胞計數、淋巴細胞計數、血小板計數、總膽紅素、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、白蛋白、血清鐵蛋白及T淋巴細胞亞群水平。

2 結果

2.1 3組一般資料比較 3組在年齡、性別構成、BMI等資料上比較,差異無統計學意義(均P>0.05),見表1。

表1 3組一般資料比較

2.2 3組白細胞計數及淋巴細胞計數水平比較 結果顯示,相較于對照組,IM組白細胞計數、淋巴細胞計數水平更高,而CAEBV組白細胞計數、淋巴細胞計數水平更低。IM組及CAEBV組白細胞計數、淋巴細胞計數水平比較均具有統計學差異(P<0.05),見圖1。

圖1 3組白細胞計數及淋巴細胞計數水平比較

2.3 3組B細胞、NK細胞及CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平比較 相較于對照組,IM組CD3+、CD4+、CD8+水平更高,而NK細胞、B細胞水平更低(P<0.05);CAEBV組CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、B細胞水平均更低(P<0.05)。IM組及CAEBV組CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、B細胞水平比較水平均具有統計學差異(P<0.05),見表2。

表2 3組B細胞、NK細胞及CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平比較

2.4 3組T細胞功能亞群、調節亞群及激活亞群水平比較 相較于對照組,IM組CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高,而CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低(P<0.05);相較于對照組,CAEBV組CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低,而CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高(P<0.05)。IM組及CAEBV組CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平比較均具有統計學差異(P<0.05),見表3、圖2。

圖2 流式細胞圖

表3 3組T細胞功能亞群、調節亞群及激活亞群水平比較

2.5 3組CD4+和CD8+初始T細胞、記憶T細胞亞群水平比較 相較于對照組,IM組效應記憶CD4+CD62L-CD45RO+、效應記憶CD8+CD62L-CD45RO+更高,而初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低(P<0.05);相較于對照組,CAEBV組初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低,而效應記憶CD4+CD62L-CD45RO+、效應記憶CD8+CD62L-CD45RO+更高(P<0.05)。IM組及CAEBV組各CD4+和CD8+初始T細胞、記憶T細胞亞群水平比較均具有統計學差異(P<0.05),見表4。

表4 3組CD4+和CD8+初始T細胞、記憶T細胞亞群水平比較

2.6 存活組及死亡組各指標水平比較 結果顯示,截止隨訪,共15例患者死亡,存活組與死亡組在EBV DNA拷貝數、血小板計數、總膽紅素、AST、白蛋白、血清鐵蛋白、CD4+CD28+、CD38+CD8+、初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平上比較均有統計學差異(P<0.05),見表5。

表5 存活組及死亡組各指標水平比較

2.7Logistic回歸分析結果 對單因素分析具有統計學差異的指標進行賦值:EBV DNA>105拷貝/mL為1,EBV DNA≤105拷貝/mL為0;血小板計數<50×1012/L為1;血小板計數≥50×1012/L為0;AST>75.92 U/L為1,AST≤75.92 U/L為0;白蛋白<30 g/L為1,白蛋白≥30 g/L為0;血清鐵蛋白>5 000 μg/L為1,血清鐵蛋白≤5 000 μg/L為0;CD4+CD28+<91.94%為1,CD4+CD28+≥91.94%為0;CD38+CD8+>33.94%為1;CD38+CD8+≤33.94%為0;初始CD4+CD62L+CD45RA+<29.87%為1;初始CD4+CD62L+CD45RA+≥29.87%為0;初始CD8+CD62L+CD45RA+<18.94%為1;初始CD8+CD62L+CD45RA+≥18.94%為0。進行Logistic回歸分析,條件為:向前,LR。結果顯示,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計數<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的獨立危險因素(P<0.05),見表6。

表6 Logistic回歸分析結果

3 討論

研究表明,EBV感染人體后,病毒胞膜糖蛋白可與B淋巴細胞膜受體CD21相結合,進而潛伏感染,促進EBV的復制。而T細胞介導的免疫應答反應可對受到感染的B淋巴細胞進行清除[13-15]。因此通過輔助檢查T淋巴細胞表達水平對于疾病的診治具有十分重要的臨床意義。

白細胞及淋巴細胞在抵御外界因素刺激中具有重要作用,而NK細胞則是機體天然免疫的主要承擔者。T淋巴細胞亞群在機體免疫機制中發揮著重要作用,其中CD3+細胞以及CD4+細胞可促進機體細胞免疫反應,而CD8+T細胞具有抑制機體免疫應答的功能。正常生理條件下,CD4+與CD8+處于動態平衡狀態。本研究結果顯示,相較于正常人群,IM患者及CAEBV患者白細胞計數、淋巴細胞計數、B細胞、NK細胞水平及T淋巴細胞亞群水平均存在一定差異,提示兩種疾病患者的免疫功能均存在紊亂情況。其中IM患者白細胞計數、淋巴細胞計數均有所上升,而B細胞及NK細胞水平則有所下降。研究表明,EBV病毒可使NK細胞失去清除病毒的能力,且在入侵機體后,可促使T細胞大量增殖,并形成強烈的細胞免疫反應,從而識別被感染的B淋巴細胞,并促進其凋亡[16-17]。此外該過程還可抑制B淋巴細胞的增殖、分化過程[18-19]。因此,在EBV感染急性期,患者可表現為T淋巴水平顯著上升,而B細胞和NK細胞水平顯著下降。而當患者未及時得到有效治療時,T淋巴細胞和B淋巴細胞之間的作用將會進一步增強,并導致B細胞活動進一步受限,導致B細胞水平進一步下降[20]。本研究結果顯示,CAEBV患者白細胞計數、淋巴細胞計數、B細胞及NK細胞計數水平均顯著下降,這也說明CAEBV患者的免疫功能紊亂情況更為嚴重。T淋巴細胞亞群中,相較于正常人群,IM組患者CD3+、CD4+、CD8+水平均顯著上升,而CAEBV患者則CD3+、CD4+、CD8+水平均有所減少。這提示IM患者CD3+、CD4+、CD8+在高度活化,從而有利于EBV的清除。而CAEBV患者由于T淋巴細胞處于下降狀態,導致難以清除EBV病毒,引起EBV的持續感染。

CD28為T細胞正常激活的第二信號,既往有研究發現,急性早期EBV感染患者存在CD28細胞下調暫時無能狀態,這可能與T細胞在參與對病毒的免疫應答過程中,已活化的T細胞暫時無反應狀態有關[21]。本研究結果顯示,相較于正常人群,IM患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平有所下降,而CAEBV患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平雖有所下降,但高于IM組水平。其可能機制為CAEBV缺乏急性早期感染階段中的CD28細胞下調無能狀態階段,而這可能也是EBV感染慢性活動性的病程特點。CD25分子參與抑制過度活化的自身免疫反應,CD4+CD25+細胞作為T細胞調節亞群可抑制免疫反應和維持機體的耐受。本研究結果顯示,IM患者CD4+CD25+水平有所上升,而CAEBV患者水平介于IM患者和正常人群之間。這可能與CAEBV患者過度自身免疫炎性反應慢性化存在一定聯系。DR+CD8+、CD38+CD8+是病毒導致細胞免疫激活的標志物之一[22]。本研究結果顯示,相較于正常人群,IM和CAEBV患者DR+CD8+、CD38+CD8+水平均顯著上升,而CAEBV患者水平低于IM組,這可能與疾病的急性早期病毒清除機制和進入慢性活動期存在一定聯系,但具體機制仍需進一步探討。初始T細胞在受到抗原刺激后可轉化為效應記憶T細胞。本研究結果顯示,相較于正常人群,IM組和CAEBV組初始T細胞水平均有所下降,而效應記憶T細胞水平有所上升,這與邢燕等[23]的研究結果較為一致,其可能機制與免疫逃逸機制導致初始T細胞生成障礙有關。而相較于IM組,CAEBV組初始T細胞水平更高,而效應記憶T細胞水平更低,表明這與CAEBV的慢性活動期存在一定聯系。

本研究進一步探討了影響CAEBV預后的可能危險因素。結果顯示,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計數<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的獨立危險因素。病毒載量過高往往提示患者可能存在持續性感染,導致病情加重。而血小板在凝血功能、血管內皮細胞再生及修復中具有重要意義。當血小板水平顯著下降時可能導致內臟器官的自發性出血,嚴重危及生命[24]。白蛋白水平下降一方面可能會導致內分泌失調,增加感染風險,另一方面白蛋白水平下降往往提示機體全身性消耗嚴重,提示患者預后較差[25]。而血清鐵蛋白與機體炎性反應存在密切聯系,其水平越高往往代表患者炎性反應越嚴重。因此,在臨床診治過程中,需密切關注上述因素,及時采取控制措施。

本研究的創新點包括:①通過分析CAEBV及IM患者淋巴細胞水平差異,從而進一步為臨床上診斷CAEBV提供新的思路。②通過隨訪獲得了影響CAEBV死亡的危險因素,為臨床上采取針對性治療措施提供相關依據。但本研究也存在以下不足:①研究納入樣本量較小。②未對各指標進行動態監測,難以獲得連續數據進一步探討其可能機制。因此,仍需后續大樣本研究加以證實。

4 結論

CAEBV患者存在淋巴細胞亞群失衡及免疫功能紊亂,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計數<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是影響患者死亡的危險因素,需及時采取控制措施。