通過式固相萃取柱凈化-光化學衍生-高效液相色譜法測定復合調味料中黃曲霉毒素的含量

岳超,徐欣豐,趙超群,袁堃,王展華,劉柱,陳碧蓮,梁晶晶*

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院,國家市場監督管理局重點實驗室(功能食品質量與安全領域), 浙江省市場監督管理局重點實驗室(保健品質量安全重點實驗室), 杭州 310052;2.浙江中醫藥大學,杭州 310053)

隨著國民生活水平不斷提高,現代人們的餐飲方式多元化加快,外賣、火鍋、麻辣燙等成為大部分居民的餐飲首選。為滿足不同的飲食需求,復合調味料使用廣泛。復合調味料成分復雜多樣,其原料、配比、加工方式、儲存條件等各不相同。復合調味料的原料如花生醬、芝麻醬、黃豆醬、辣椒油等均存在霉菌毒素污染的風險[1-6],為追求經濟效益,存在不法商家使用價廉質次或陳貨進行調配的可能,使得該類食品存在較高的安全隱患。

黃曲霉毒素現行有效的國家標準為GB 5009.22-2016,標準中共涉及5個方法,其中第一、二、三法均采用免疫親和柱凈化。此凈化方法耗時長、操作復雜、價格昂貴,且用于基質復雜樣品時過柱困難、準確度低等問題尤為突出。近年來,通過式的凈化固相萃取柱,如EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A等廣泛用在檢測藥物殘留、污染物殘留方面[7-13],此類親脂、親水的新型凈化集提取、濃縮、凈化為一體,可以有效地去除樣品中的脂肪、蛋白質、磷脂等雜質,且無需活化、平衡,實驗操作步驟少,檢驗效率和結果準確度高,但在真菌毒素測定中的應用主要集中在糧食制品和食用油上[14-16],在高油脂、高鹽、高蛋白的復合調味料中的應用較少見。

基于復合調味料組成復雜、基質干擾大的特點,本研究建立并優化通過式固相萃取柱凈化方法,對花生醬、芝麻醬、黃豆醬、豆豉醬、豆腐乳5種復合調味料共計42批樣品中的黃曲霉毒素進行測定,了解復合調味料中黃曲霉毒素的污染風險情況,以期為完善復合調味料中黃曲霉污染風險控制提供對策,為完善法規標準提供數據參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

XR-20AD型高效液相色譜儀(配RF-20A熒光檢測器) 日本島津公司;Milli-Q去離子水發生器 美國Millipore公司;萬分之一分析天平 梅特勒-托利多公司;KH5200DE型超聲波清洗器 昆山禾創公司;J-34-4型高速研磨勻漿機 深圳市新銳科技發展有限公司;渦旋振蕩儀 IKA公司;高速離心機 賽默飛世爾科技公司。

黃曲霉毒素(AF,下同)B1、B2、G1、G2混合對照品溶液濃度分別為1.08,0.33,1.01,0.30 μg/mL(批號:610001-202107,中國食品藥品檢定研究院);乙腈、甲醇均為色譜純;實驗用水為超純水。實驗中黃豆醬8批、豆豉醬6批、豆腐乳8批均為市購,花生醬10批和芝麻醬10批為餐飲店中的自制調味料。

1.2 實驗部分

1.2.1 色譜條件

流動相為乙腈-甲醇-水(20∶20∶60,下同);色譜柱為Zorbax C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫為35 ℃,流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,熒光檢測器激發波長λex=360 nm,發射波長λem=440 nm。此條件下AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2色譜峰分離度良好,色譜圖見圖1。

1.2.2 標準品的配制

精密吸取黃曲霉毒素對照品混合溶液 0.5 mL置于5.0 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容得到混合對照品工作溶液,于-18 ℃保存備用。

1.2.3 樣品溶液的制備

稱取充分粉碎混勻的試樣5.0 g,置于50 mL 離心管中,加入4顆鋼珠,準確加入40 mL 80%乙腈-水溶液,高速研磨振搖提取10 min,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,上清液待凈化。待凈化液直接上柱,收集濾液于10 mL離心管中,準確吸取4.0 mL流出液在45 ℃條件下氮氣吹干,加入1 mL初始比例流動相復溶,渦旋溶解30 s,通過0.22 μm有機濾膜,待測。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

本研究參考國標方法、《中國藥典》方法及現有文獻報道方法[3,5,13-14,17]。常用的黃曲霉毒素提取溶液為不同體積比的甲醇-水溶液和乙腈水溶液。結合研究樣品基質特點及目標物結構特點,實驗考察了70%甲醇-水溶液、70%甲醇-0.1%甲酸水溶液、80%乙腈-水溶液、80%乙腈-0.1%甲酸-水溶液、84%乙腈-水溶液、84%乙腈-0.1%甲酸-水溶液為提取液時黃曲霉毒素的回收率結果,見圖2。

圖2 不同提取溶劑對4種黃曲霉毒素回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recovery rates of AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

由圖2可知,乙腈-水溶液為提取溶劑時,黃曲霉毒素的回收率為77.6%～87.6%,明顯高于甲醇-水溶液。甲醇易提取出樣品中的酸類、醇類、酚類物質,甲醇-水溶液提取離心后,提取液仍渾濁,直接影響后續樣品的過柱速度。乙腈為提取液時對脂肪、蛋白、色素等雜質提取較少,適用于后續步驟中固相萃取柱填料的凈化需求。黃曲霉毒素對酸度不敏感,提取效率不受甲酸含量的影響。因此,實驗最終選擇80%乙腈-水溶液為提取溶劑。

2.1.2 凈化方式的選擇

實驗以陰性花生醬的加標樣品為研究對象,選取EMR-Lipid、PRiME-HLB、ProElut Pls-A、MycoSep 226 4種通過式固相萃取柱凈化,考察3種加標濃度水平下各黃曲霉毒素的回收率,并與免疫親和柱凈化測得的回收率結果進行比較,結果見圖3。

圖3 不同基質樣品黃曲霉毒素的回收率結果Fig.3 The recovery rates of aflatoxins in different substrates

復合調味料樣品基質組成復雜,油脂、蛋白質、色素、糖類、食鹽等物質含量高,提取液中溶解的油脂、色素等雜質較難去除,導致其加標回收率結果低于其他食品類別。經過PRiME-HLB柱和EMR-Lipid柱凈化后,4種黃曲霉毒素的回收率與免疫親和柱差異小,且AFB1和AFB2的回收率更優;ProElut Pls-A的回收率為57.8%～61.3%,且圖譜中干擾大,基線不平,對AFG2的結果準確性影響大;MycoSep 226柱凈化對AFG2的回收率影響大,回收率為52.7%～55.6%。

免疫親和柱凈化時特異性強,但本基質樣品提取液無法順利通過免疫親和柱進行吸附,且洗脫液復溶后仍會出現白色沉淀。EMR-Lipid和PRiME-HLB凈化柱均有很好的凈化效果,EMR-Lipid為增強型脂質凈化材料,基于體積排阻和疏水相互作用的結合來去除脂質,但PRiME-HLB對含有鹽、蛋白、磷脂等物質的凈化效果更好。依據復合調味料的組成和黃曲霉毒素的結構特點,最終選擇PRiME-HLB為凈化柱。

2.1.3 提取方式和提取時間的選擇

研究過程中發現,豆豉醬在振搖提取過程中容易結團,提取液與樣品的接觸面積小,使得提取效率低。花生醬和芝麻醬的振搖提取效果好,但30 min才可以提取完全,使得提取液乳化嚴重。本研究選擇高速研磨均質儀,使用鋼柱碰撞進而防止樣品結團,實現勻漿和振搖提取同時進行。超聲提取可以促使植物組織破壁、變形,提取效率高。實驗考察了10～30 min的提取效果,最終選擇高速研磨均質10 min后超聲提取10 min。

2.1.4 復溶溶解的選擇

實驗比較了甲醇、黃曲霉提取液、初始比例流動相溶液為稀釋溶劑時的結果差異。3種溶劑對回收率的影響小,但初始比例流動相復溶時,其溶劑效應小、基線平穩,在測定低濃度AFG2時準確度較其他兩種溶劑高。實驗最終選擇初始比例流動相溶液為復溶溶劑,并高速渦旋1 min充分溶解。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍與定量限

用初始比例流動相溶液稀釋混合對照品工作溶液,配制得到7個水平濃度的標準曲線溶液。按照1.2.1項色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標(y)、對照品濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線,計算回歸方程及相關系數(R2)。結果表明,4個目標物在相應質量濃度范圍內線性關系良好。以信噪比S/N=10確定方法的定量限(LOQ),結果見表1。

2.2.2 精密度和重復性實驗

取第二濃度點混合對照品溶液,連續測定6次,記錄4個目標物的峰面積并計算RSD。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的精密度RSD(n=6)分別為0.06%、0.18%、1.06%、0.87%。結果表明儀器的精密度良好。

平行制備陽性樣品6份,測定并計算4個目標物含量。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量的RSD(n=6)分別為0.67%、2.27%、1.04%、2.67%。結果表明該方法的重復性良好。

2.2.3 不同樣品的回收率及精密度

取豆腐乳、花生醬、芝麻醬、黃豆醬、豆豉醬的陰性樣品,依照國標中定量限要求(AFB1和AFG1為0.1 μg/kg,AFB2和AFG2為0.03 μg/kg)分別加1×LOQ、5×LOQ、10×LOQ 3個水平濃度的混合對照品溶液進行回收率實驗。回收率及RSD結果見表2。 結果顯示AFB1和AFG1的回收率均高于AFB2和AFG2,豆腐乳的回收率低于其他樣品。

表2 4種黃曲霉毒素在不同調味醬中的加標回收率及相對標準偏差Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of four kinds of aflatoxins in different seasoning sauces

表3 樣品中黃曲霉毒素檢出情況Table 3 Detection conditions of aflatoxins in samples

2.3 樣品的測定

采用PRiME-HLB固相萃取柱,按照1.2.3項方法制備44批樣品的供試品溶液,測定樣品中黃曲霉毒素的含量。結果顯示,黃豆醬中檢出2批次,豆腐乳中檢出1批次,豆豉醬中未檢出。餐飲店自制花生醬和芝麻醬中黃曲霉毒素的檢出率高,含量范圍AFB1為0.309～4.17 mg/kg,AFB2為0.129～1.01 mg/kg,AFG1為0.219～2.62 mg/kg,AFG2為0.243～1.75 mg/kg,樣品中AFB1均符合GB 2761-2017中限量要求。但1批花生醬黃曲霉毒素含量較高,AFB1為28.9 mg/kg,AFB2為1.01 mg/kg,AFG1為15.4 mg/kg,AFG2為1.69 mg/kg,且AFB1不符合GB 2761-2017中限量要求。

3 結論

本研究建立PRiME-HLB固相萃取柱直接通過的凈化方式測定復合調味料中黃曲霉毒素的方法。相較于國標中第一、二、三法,本方法更快速、便捷、環保、準確。有效地去除了樣品基質中油脂、糖、鹽、蛋白質等雜質的干擾,進而提高了樣品結果的準確性。PRiME-HLB柱凈化過程中無需活化和平衡,上柱溶液無需稀釋,檢驗操作步驟少,檢測效率高,重復性好,更適用于大批量樣品的檢測。

本研究結果顯示,預包裝復合調味料樣品中黃曲霉毒素污染率低,餐飲店中自制樣品的黃曲霉毒素污染率高。黃曲霉毒素B族的污染率高于G族,且黃曲霉毒素B1的污染風險最大。餐飲店中自制調味料的原料配比、制作手法各不相同,原料中可能存在同時產生黃曲霉毒素B族和G族的菌株,增加黃曲霉毒素的污染風險,應加強對餐飲店自制調味料中黃曲霉毒素的監管力度。此外,GB 2761-2017標準中僅對AFB1的限量值進行了規定,并無對黃曲霉毒素總量的限量要求。依據“四個最嚴”的要求,為完善對復合調味料中黃曲霉毒素污染風險的監控,避免此類食品安全問題的發生,建議增加對堅果及籽類、調味品中黃曲霉毒素總量的限量要求。