二維液相色譜在食品檢測方面的應用進展

邢倩倩

(1.乳業生物技術國家重點實驗室,上海乳業生物工程技術研究中心,光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海 200436;2.食品營養與安全協同創新中心,江蘇 無錫 214122)

隨著食品工業的發展,對現代分析技術提出了更高要求,需表征盡可能多的食品組成成分和使檢測的微量食品組分達到更高的靈敏度,進而了解食品物質組成基礎[1]。近些年伴隨著分析化學的進展,易操作的先進儀器逐步出現,傳統食品分析方法正在逐步被功能強大的分析技術所取代,如多維色譜技術和質譜技術在食品分析方面的廣泛應用[2]。二維液相色譜在揭示食品復雜基質組成、提供高分離能力和未知調味化合物識別方面具有明顯優勢[3]。

1 二維液相色譜簡介

1.1 原理

二維分離的理念由Giddings[4]提出,通過將兩個獨立的色譜分離過程組合到一起實現,在該分離過程中樣品經過兩次不同機理的分離過程,因此分離能力遠高于傳統一維分離。傳統的一維色譜在分離復雜樣品過程中會發生峰交叉、共流出和分離度不足等現象,說明一維色譜存在峰容量不足的問題。二維液相色譜對復雜樣品的分辨率遠高于傳統一維液相色譜,該分辨能力即峰容量。峰容量是指色譜體系中用最小分離度分得的最多峰個數的理論值[5]。二維液相色譜的理論峰容量為兩種分離模式峰容量的乘積。因此,建立二維液相色譜應盡量選擇兩種不同的分離模式,保證正交性最大,即充分利用兩種分離模式的峰容量[6]。

在實際應用中,二維液相色譜可通過組分由第一維到第二維的轉移方式分為離線、在線或流速停止模式[7]。在離線二維液相色譜模式中,首先手動接出一維分離后的各個組分,處理后直接進入第二維分離模式。在線二維液相色譜模式中,第一維和第二維通過接口或是調諧器連接,可自動收集一維組分直接進入第二維進行分析[8—10]。流速停止二維液相色譜模式中,第一維流速停止開始第二維分離過程,第二維完成后再重啟第一維分離模式,完成后再依次開啟第二維分離模式。

1.2 分類

二維液相色譜包括中心切割二維色譜和全二維液相色譜。中心切割模式可應用于對第一維色譜中某個特定組分進行第二維分離的過程,全二維模式應用于對于第一維色譜中所有組分進行第二維分離的過程。在全二維分離模式中,必須保證第一維的組分無損傷地全部進入第二維,即需要保證第一維的樣品收集率比較高。

1.3 特點

二維液相色譜系統在分離能力方面遠強于傳統一維色譜,這也是其成功應用于食品分析的最大優點[11]。另外,二維液相色譜系統也可與質譜串聯使用,提高分離效率和識別能力[12]。基于二維液相色譜具有諸多優點,近些年在食品方面應用愈加廣泛。本文針對近些年二維液相色譜在食品分析方面的應用展開討論。

2 二維液相色譜在食品溯源和安全方面的應用

食品中的風險物質和危害物質可由多種因素引入。食品污染物一方面來源于農藥、殺蟲劑、環境污染物、抗生素以及為應對食品需求增長而使用的藥物等,另一方面則由食品攜帶或本身產生,如病原微生物污染、加工過程中生成的毒素和風險物質等,以上所列物質均對健康有害。因此,為了規范這些有害化合物的存在,需嚴格控制食品生產、加工和儲存過程中相關物質的允許限量。

在食品風險物質檢測方面,傳統分析技術所面臨的挑戰包括食品樣品中所含化合物種類多而復雜,目標化合物含量范圍過寬以及基質自帶的未知潛在毒性物質等。因此,在傳統的食品分離分析中,需要經過復雜費時的前處理過程才能完成目標化合物的檢測。在檢測食品中風險物質方面,能夠克服傳統分析缺點的分析技術是重要的發展方向[13]。傳統分析方法在分析食品污染物時由于樣品前處理導致目標化合物丟失或轉移從而降低準確性,食品安全分析中使用二維液相色譜方法可經過較少或不經過前處理步驟分析檢測識別目標化合物,從而避免該類失誤。

2.1 二維液相色譜在食品溯源方面的應用

Ianni等[14]采用中心切割二維液相色譜法,該二維系統采用反相色譜柱串聯手性色譜柱組成,用于評估來自兩頭具有不同“加州乳腺炎測試”評分的奶牛的牛奶樣品中丹磺酰化氨基酸對映體含量的變化,結果顯示隨著乳腺炎發展程度加重,丹磺酰化氨基酸含量水平逐漸降低,該結果可建立數學模型以用于早期乳腺炎的診斷。Alvim-Jr等[15]建立在線反相手性二維色譜系統串聯三重四級桿檢測器完成人乳中的氟西汀和諾氟西汀的含量檢測,該研究結合RAM-BSA C18色譜柱與ChirobioticTMV2色譜柱,提供了一種具有高靈敏度、無基質效應、分析時間僅為25 min、幾乎無需樣品制備且溶劑用量較少(每次運行 10 mL)的方法,該方法成功應用于分析母乳樣品,可用于藥代動力學研究和常規藥物監測。與Alvim-Jr同一課題組的Lopes等[16]將Alvim-Jr所建立的方法拓展至初乳樣品中,并按照歐洲藥品管理局指南完成方法驗證。

指紋圖譜技術可用于分離、識別和比較復雜樣品的相關成分,二維液相指紋色譜可通過提供二維圖像來實現相關功能。全二維液相色譜串聯質譜可用于完成復雜樣品非靶向指紋識別,以獲得樣品化合物信息的完整圖譜。全二維指紋圖譜對分析方法的分離參數要求較高,需在保證不丟失信息的情況下最大化實現復雜樣品基質分離,同時要應對由于缺乏能夠直接處理二維液相色譜提供的復雜原始數據的軟件而導致的數據處理挑戰。使用二維液相色譜方法來評估受保護的原產地名稱(protected designation of origin,PDO)的真實性便是二維液相指紋圖譜技術一種代表性應用。PDO是一項歐洲質量認證,由歐盟農產品檢驗認證機構頒發,授予具有良好固定品質(包括地理來源、加工和感官特性)的食品,該認證旨在保護成員國優質食品和農產品。來自卡拉布里亞(意大利)的甘草是具有高感官品質和豐富生物活性的化合物,已被認證為PDO產品。Montero等[17]開發親水反相二維液相色譜方法,用于分析來自不同國家(意大利、中國、伊朗和阿塞拜疆)的甘草次級代謝產物,并與卡拉布里亞(意大利)的甘草次級代謝產物對比,ZIC-HILIC固定相用作第一維色譜柱,選擇C18用作第二維色譜柱,該結果成功鑒定出可作為分析甘草地理來源評估的潛在標記物。

Zhang等[18]建立親水反相二維液相色譜串聯離子淌度四極桿飛行時間質譜完成43種紅參和37種白參指紋圖譜的建立和對比。該工作分析流程:第一步,確定24種人參皂苷標準品的碰撞截面值;第二步,使用人參皂苷數據庫對檢測到的化合物進行結構鑒定,結構鑒定所需關鍵參數為峰檢測時間、強度閾值、質量準確度、碰撞截面值、耐受性和保留時間;第三步,使用Progenesis QI 2.1軟件處理原始數據完成標志物檢測;第四步,對檢測到的離子進行光譜解卷積和歸一化,獲得包含保留時間、m/z 和歸一化峰面積的數據矩陣;第五步,使用Ezinfo 3.0軟件對所得矩陣進行化學計量學分析,化學計量學分析包括應用無監督主成分分析和監督正交偏最小二乘判別分析。該研究成功檢測出用于區分紅參和白參品種的9種人參皂苷,實現不同人參品種的溯源。

2.2 二維液相色譜在食品安全方面的應用

2.2.1 化學性危害

多環芳烴是食品中廣泛存在的化學污染物之一,其在食品中的含量與食品來源有關,主要通過烹飪過程、工業食品加工或環境污染產生。多環芳烴具有毒性、致癌和致突變作用,其在食品中的存在易對人類健康產生不利影響。由于多環芳烴的結構多樣導致其異構體數量多,因此分析該類化合物非常困難,二維液相色譜的強大分離能力可解決該問題。Nestola等[19]建立中心切割二維液相色譜串聯氣質聯用色譜法分析多種食物基質中的多環芳烴,該系統中第一維色譜柱選擇硅膠柱用于去除甘油三酯并保留多環芳烴和不飽和物成分,自動進入第二維去除不飽和物并完成多環芳烴分離,第二維組分進入氣質聯用儀完成定量分析檢測。該研究提出了一種結合不同色譜分離策略分析多環芳烴的有效方法,成功用于檢測橄欖油、葵花籽油、雞蛋、番茄醬或蛋黃醬等樣品中的多環芳烴含量。

食品中常見的化學性危害物還包括除草劑和抗生素等。Donato等[20]建立二維液相色譜法用于檢測紅酒中除草劑,在一維中使用氰基色譜柱,在二維中使用C18色譜柱。此外,為了增加兩種分離機制之間的正交性,在第二維中使用了60 s的移動梯度。該工作除了檢測紅酒的酚類成分外,還檢測到了痕量的除草劑滅草隆。通常認為在線二維液相色譜的局限性之一是靈敏度低,主要是由于分析物在二維色譜中受到流動相兩次稀釋;該成果中檢測限(LOD)為1 mg/L,表明對葡萄酒中所含化合物的分離和定量具有非常高的選擇性和靈敏度。Wang等[21]建立親水反相二維色譜系統串聯質譜檢測器檢測乳制品中七大類20種抗生素殘留,該方法可一次性完成乳中多種抗生素殘留檢測,成功應用于5種乳粉、5種液態奶和5種生奶的抗生素含量測定。

2.2.2 生物性危害

真菌毒素是由曲霉屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬等幾種絲狀真菌產生的一組低分子量的有毒次生代謝產物,該類化合物攝入后可在動物和人類中引起多種疾病。Campone等[22]成功開發中心切割二維液相色譜串聯質譜法同時測定啤酒中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,伏馬毒素B1、B2和赭曲霉毒素A的含量分析。該方法運行時間為37 min。選擇兩種啤酒對該方法進行了驗證,可滿足食品中霉菌毒素測定方法的相關標準(EC Decision 657/2002和Regulation(EC) No.401/2006)。與一維技術相比,該二維方法檢測過程中干擾物顯著減少,基質效應也大大減少。

食品溯源和安全是食品研究方向的一項重要議題,以上所述案例對于食品溯源和安全研究具有借鑒意義。

3 二維液相色譜在食品質量和添加劑方面的應用

3.1 二維液相色譜在食品質量方面的應用

食品質量是食品的重要標志性參數,控制食品質量才能保證其感官性質。調味品作為食品工業的一個重要方面,色譜技術已應用在調味品的化學物質基礎表征方面[23-25]。二維液相色譜作為適合評價食品質量的技術,在該方面應用已較多。Pickrahn等[26]建立液相色譜和固相萃取制備結合方法(HPLC-SPE-HPLC)用于表征兩種調味品大料提取物中的味覺成分,樣品首先在第一維色譜中分離出16個組分,進而通過SPE完成溶劑替換,然后進入第二維色譜完成分離;該分離系統制備出的256個組分使用超高效液相色譜串聯飛行時間質譜完成表征,表明該調味品的甜味主要由反式茴香腦提供,苦味由反式偽異丁香酚-2-甲基丁酸酯提供。

3.2 二維液相色譜在食品添加劑方面的應用

在食品工業界,不法商家會通過添加被禁止的成分來偽裝成更高質量的產品,或是添加限量物質增強風味,色譜已應用于不同食品中添加劑的限量檢測[27—28]。Hou等[29]開發了一種簡便快速的停流速中心切割二維液相色譜方法,第一維使用C4色譜柱,第二維使用C18色譜柱,用于同時定量酸奶中的5種添加劑,包括阿斯巴甜、苯甲酸、那他霉素、糖精鈉和山梨酸,該方法總分析時間為30 min,樣品加標回收率在94.5%～103.9%之間。Hou等[30]建立中心切割二維液相色譜法分析牛奶和奶粉中的5種主要蛋白質(α-酪蛋白、β-酪蛋白、乳清蛋白、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白)和7種添加劑(麥芽糖醇、乙基麥芽糖醇、香蘭素、乙基香蘭素、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉),該方法中第一維色譜能夠將添加劑和蛋白質分成兩組,呈現較高極性的添加劑從C4柱中快速洗脫并截留在捕集柱中以在第二維C18色譜柱中進一步分析,而蛋白質主要保留在第一維色譜柱中分析。添加單糖,如果糖、半乳糖或葡萄糖也是一種增強奶粉風味的摻假方法,Ma等[31]開發了一種二維液相色譜方法評估分析各種品牌和不同種類奶粉中單糖的存在,該方法使用無需樣品前處理的中心切割二維液相色譜方法,研究對象包括全脂、脫脂和嬰兒配方奶粉以及豆奶粉,該方法檢測出部分奶粉樣品中含有葡萄糖。

食品質量和添加劑對食品工業行業發展尤為重要,以上所述策略對于食品質量和真偽研究具有借鑒意義。

4 二維液相色譜在食品營養和健康方面的應用

由于食品是非常復雜的基質,因此它們的分離和表征非常困難。二維液相色譜可有效解決復雜基質分離分析過程中所遇到的挑戰[32]。眾所周知,食物的營養成分含量與其生物活性之間具有量化關系。現在食品科學領域的大部分研究涉及食品營養或食品健康。基于二維液相色譜在分離分析方面的優點,其在食品營養與食品健康方面應用前景廣闊[33—34]。二維液相色譜適合表征和鑒定食品基質中存在的營養成分,這些化合物通常是微量成分[35—37]。采用非靶向分析對包含目標組分的基質進行全組分分析是理想的解決復雜基質中微量組分分離分析的手段[38]。

4.1 二維液相色譜在食品營養方面的應用

酚類化合物是水果飲品中的代表性營養調味物質,該類物質的色譜表征已較成熟[39]。Aly等[40]選擇綠色環保溶劑替代部分傳統溶劑建立在線全二維液相色譜分析鑒別葡萄汁和葡萄酒中的酚類化合物,這項研究首次嘗試用綠色二維液相色譜,試圖在不影響分離能力的情況下更環保地實現該類物質的分離分析。Brazdauskas等[41]采用綜合二維液相色譜完成黑莓果渣中營養物質的化學表征,可分離出61種不同成分,可初步鑒定不同花青素、原花青素、黃酮類化合物和酚酸等營養調味物質。Montero等[42]建立親水反相串聯紫外質譜二維方法用于分析多個品種葡萄藤中的(多)酚類營養調味物質,首次在葡萄藤中檢測出高度聚合的二苯乙烯類化合物,該方法顯示出高峰容量(842)和良好的正交性(78%)。

二維液相色譜方法已廣泛用于食品功能活性物質的制備,用于此目的的二維液相色譜配置通常是離線制備型二維液相色譜,該系統能夠從第一維手動收集相對較大量的餾分,這些餾分可以適當濃縮并重新溶解,以便在第二維中進行分析。Fan等[43]建立制備型二維液相色譜方法用于分離甘草中黃酮類化合物,本成果中離線二維液相色譜成功用于純化甘草中的低濃度物質,在16.8 h內純化24種純度高于90%的黃酮類化合物,表明離線二維制備色譜可用于分離活性營養成分用于活性研究。Zenezini等[44]建立二維液相色譜用于從驢奶中純化肽,并對其進行表征,首先通過反相一維純化具有抗氧化和血管緊張素轉化酶抑制活性的驢奶肽,然后在第二維親水色譜分離中進一步分析,通過篩選分離的肽的生物活性,其中兩個顯示出抗氧化活性,另外兩個顯示出血管緊張素轉化酶抑制作用。

4.2 二維液相色譜在食品健康方面的應用

二維液相色譜方法也可用于在線篩選化合物生物活性,通常第一維中使用細胞膜色譜,色譜柱中填充研究生物活性的特定受體,第二維則是分離目標化合物。細胞膜色譜由細胞膜固定相組成,該固定相是將含有目標化合物特定受體的細胞膜固定在活性二氧化硅上制備所得。Cao等[45]采用該方法成功從3種藥食兩用物質中篩選出5種抗炎成分。

食品研究中,不僅食品成分重要,其相關的生物活性也很重要。以上所述策略對于食品營養和健康研究具有借鑒意義。

5 展望

綜上所述,二維液相色譜是食品領域研究的一個非常有價值的工具。二維液相色譜方法在提高分辨率、獲得化合物結構信息、易與質譜聯用以及縮短樣品制備時間方面具有明顯優勢。

盡管二維液相色譜在食品方面的應用已經比較廣泛,但仍有較大的提升空間。接口技術、耐用性、定量、化學計量學、數據處理等的發展有助于提高二維液相色譜在食品分析方面的應用價值。未來,二維液相色譜將在食品調味營養物質表征、食品質量和食品安全等方面發揮巨大作用。