蠶豆醬發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能分析

曾麗麗,聶珍珍,李紫陽

(1.永城職業(yè)學(xué)院,河南 商丘 476600;2.東北財經(jīng)大學(xué),遼寧 大連 116012)

豆類發(fā)酵產(chǎn)品是一種傳統(tǒng)的調(diào)味品,深受東南亞地區(qū)消費者喜愛[1-2]。隨著社會的發(fā)展,國內(nèi)外的醬類類別和品牌逐漸多樣化,主要包括蠶豆醬、面醬、醬油、腐乳和黃豆醬等[3],這些豆類調(diào)味品的主要原材料為小麥、大豆和蠶豆等[4-5]。蠶豆醬又被稱為豆瓣醬,主要由蠶豆和面粉組成[6],先將其使用米曲酶進行發(fā)酵后再制成調(diào)味醬[7]。

傳統(tǒng)的蠶豆醬發(fā)酵使用半開放式的多菌種混合發(fā)酵加工工藝,包括霉菌制曲和鹽水發(fā)酵兩個階段[8-9]。先將原料高溫處理,之后進行淀粉糊化和蛋白質(zhì)變性[10],進行人工接種,再將接種好的原料混勻進行自然發(fā)酵[11];蠶豆醬在微生物作用下,很多大分子物質(zhì)被分解成小分子的氨基酸、多肽和糖類物質(zhì)[12-13],形成具有獨特醬香風(fēng)味的調(diào)味醬[14]。

高鹽濃度和微酸環(huán)境是蠶豆醬的特征,高鹽環(huán)境不僅增強了人們對蠶豆醬的食欲[15],而且抑制了蠶豆醬中微生物生長,延長了蠶豆醬的儲藏時間[16];蠶豆醬發(fā)酵過程中蛋白酶和淀粉酶的降解、氨基酸態(tài)氮和還原糖的生成都直接影響蠶豆醬中風(fēng)味成分的形成[17]。

本研究通過分析蠶豆醬的理化性質(zhì)隨著發(fā)酵時間延長的變化情況,再利用宏基因技術(shù)對發(fā)酵過程中蠶豆醬中的真菌和細(xì)菌群落多樣性和豐富度進行研究,為蠶豆醬發(fā)酵技術(shù)和工廠化加工奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

選用來自同一批次的發(fā)酵蠶豆醬,其發(fā)酵時間依次為0,1,2,3,4,5,6,13,20,27,34,41,48,55 d,獲得樣品后,將樣品置于-80 ℃冰箱中保存待用。

試劑:水楊酸、苯酚、甲醛、氯化鈉、鹽酸、硫酸鋅、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氫氧化鈉和硝酸鉀。

1.2 試驗儀器

PCR儀、分光光度計、凝膠成像儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、萃取頭、pH計、高速冷凍離心機和高效液相色譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標(biāo)及揮發(fā)性成分測定

采用硝酸銀滴定法測定鹽度;使用pH計測定pH值;采用酸堿滴定法和甲醛滴定法測定可滴定酸度和氨基酸態(tài)氮含量;采用福林酚-法測定蛋白酶活性;采用二硝基水楊酸測定葡萄糖淀粉酶活性;采用HPLC法測定游離氨基酸和有機酸含量。

1.3.2 宏基因測序

使用DNA試劑盒提取DNA,然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度和完整性。將提取的DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS軟件和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理和分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 理化指標(biāo)和風(fēng)味分析

2.1.1 理化指標(biāo)的跟蹤分析

由圖1可知,蠶豆醬發(fā)酵過程中水分含量先增加后變化不大。當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬中的水分含量快速增加,當(dāng)發(fā)酵至第6天時,蠶豆醬中的水分含量為58%。當(dāng)發(fā)酵時間大于6 d時,蠶豆醬中的水分含量基本為57%～58%,即使發(fā)酵時間不斷增加,蠶豆醬中的水分含量也不再發(fā)生變化。

圖1 蠶豆醬發(fā)酵過程中水分含量的變化情況Fig.1 Change of moisture content during thefermentation of broad bean paste

由圖2可知,當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬的鹽度隨著發(fā)酵時間的增加而逐漸增加。當(dāng)發(fā)酵至第6天時,蠶豆醬的鹽度為12%;當(dāng)發(fā)酵時間大于6 d時,蠶豆醬的鹽度呈現(xiàn)上下波動的趨勢,但基本保持穩(wěn)定,鹽度維持在12%～14%之間。

圖2 蠶豆醬發(fā)酵過程中鹽度的變化情況Fig.2 Change of salinity during the fermentation of broad bean paste

由圖3可知,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬的pH值呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬的pH值快速降低。當(dāng)發(fā)酵時間大于6 d時,蠶豆醬的pH值開始緩慢降低。當(dāng)蠶豆醬發(fā)酵剛開始時,蠶豆醬中的可滴定酸度為3%,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中的可滴定酸度逐漸增加。

圖3 蠶豆醬發(fā)酵過程中可滴定酸度和pH值的變化情況Fig.3 Changes of titratable acidity and pH value during the fermentation of broad bean paste

由圖4可知,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量緩慢增加;當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量快速增加;當(dāng)發(fā)酵時間大于6 d時,蠶豆醬中的氨基酸態(tài)氮含量仍呈現(xiàn)增加趨勢,但是增加的幅度較小。

圖4 蠶豆醬發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化情況Fig.4 Change of amino acid nitrogen content during the fermentation of broad bean paste

由圖5可知,蠶豆醬發(fā)酵過程中,還原糖呈現(xiàn)先增加后波動不大的趨勢,當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬中的還原糖含量快速增加,從13%增加到25%;當(dāng)發(fā)酵時間大于6 d時,蠶豆醬中的還原糖含量維持在25%～26%,基本保持不變。

圖5 蠶豆醬發(fā)酵過程中還原糖含量的變化情況Fig.5 Change of reducing sugar content during the fermentation of broad bean paste

由圖6可知,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中的蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬中蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性快速下降,隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加,蠶豆醬中的蛋白酶活性和葡萄糖淀粉酶活性下降的速度逐漸緩慢。

圖6 蠶豆醬發(fā)酵過程中蛋白酶和葡萄糖淀粉酶活性的變化情況Fig.6 Change of protease and glucoamylase activities during the fermentation of broad bean paste

圖7 非揮發(fā)性有機酸隨發(fā)酵時間的變化情況Fig.7 Change of non-volatile organic acids with fermentation time

由圖1～圖6可知,當(dāng)蠶豆醬發(fā)酵時間小于6 d時,蠶豆醬中微生物快速繁殖,導(dǎo)致蠶豆醬中的水分、鹽度、可滴定酸度、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量快速增加;隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加,蠶豆醬中的水分、鹽度、可滴定酸度、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量緩慢增加或基本保持不變。

2.1.2 風(fēng)味代謝跟蹤分析

蠶豆醬中的非揮發(fā)性有機酸包括乙酸和乳酸,當(dāng)發(fā)酵時間小于13 d時,蠶豆醬中的非揮發(fā)性有機酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;蠶豆醬中的乙酸含量基本為3～15 g/kg,乳酸含量為17～55 g/kg;當(dāng)發(fā)酵時間為20～55 d時,蠶豆醬中的乳酸和乙酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

由圖8可知,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分不斷增加。蠶豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、酚類和酸類等。蠶豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量較高的包括醇類和酯類,其隨著發(fā)酵時間的增加而不斷增加,而其他揮發(fā)性風(fēng)味成分醛類、酮類、酚類和酸類等含量較少,隨著發(fā)酵時間的增加,這些揮發(fā)性風(fēng)味成分無明顯變化。

圖8 揮發(fā)性風(fēng)味成分隨發(fā)酵時間的變化情況Fig.8 Change of volatile flavor components with fermentation time

2.2 微生物群落多樣性分析

通過擴增子測序方式對蠶豆醬中的細(xì)菌和真菌群落進行分析,結(jié)果見表1,樣品的覆蓋率均為100%,說明數(shù)據(jù)的深度和質(zhì)量較可靠。

表1 Illumina 測序的統(tǒng)計信息Table 1 Statistics of Illumina sequencing

表2 蠶豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢屬Table 2 Dominant genera in the fermentation process of broad bean paste

通過對蠶豆醬中的真菌和細(xì)菌多樣性指數(shù)Shannon、Chao 1和觀測點進行分析,發(fā)現(xiàn)蠶豆醬中細(xì)菌群落在發(fā)酵第1天時多樣性最大、豐富度最高,之后隨著環(huán)境壓力及脅迫增強,蠶豆醬中的細(xì)菌群落多樣性和豐富度開始降低。蠶豆醬中真菌多樣性和豐富度的變化呈上下波動趨勢,多樣性及豐富度變化并不明顯。

由圖9和圖10可知,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

圖9 蠶豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的聚類分析Fig.9 Clustering analysis of bacterial community during the fermentation of broad bean paste

圖10 蠶豆醬發(fā)酵過程中真菌群落的聚類分析Fig.10 Clustering analysis of fungal community during the fermentation of broad bean paste

2.3 微生物群落的組成及定量分析

微生物是蠶豆醬發(fā)酵的重要組成部分,在蠶豆醬發(fā)酵過程中發(fā)揮著不可替代的作用,通過對蠶豆醬樣品進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)相對豐富度大于1%的細(xì)菌種類包括葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、未分類A屬和B屬;相對豐富度大于1%的真菌種類包括曲霉屬和接合酵母屬。

3 小結(jié)

微生物生長發(fā)育受季節(jié)性的影響,隨著豆醬發(fā)酵的不斷進行[18-19],豆醬中的微生物群落呈現(xiàn)相互交替,從而發(fā)生一系列的生化反應(yīng),影響蠶豆醬食品的質(zhì)量[20]。本研究對發(fā)酵蠶豆醬中各種理化性質(zhì)進行了分析和研究,結(jié)果表明,蠶豆醬發(fā)酵初期微生物快速繁殖,導(dǎo)致蠶豆醬中的水分、鹽度、可滴定酸度、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量快速增加;隨著發(fā)酵時間持續(xù)增加,蠶豆醬中的水分、鹽度、可滴定酸度、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量緩慢增加或基本保持不變。

通過宏基因技術(shù)對發(fā)酵過程中蠶豆醬的微生物群落進行分析,結(jié)果表明,發(fā)酵剛開始時,蠶豆醬中的細(xì)菌多樣性和豐富度較高,隨著發(fā)酵時間的增加,蠶豆醬中的細(xì)菌群落基本保持穩(wěn)定;而發(fā)酵時間的長短對蠶豆醬中的真菌群落變化影響不明顯。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時,蠶豆醬中的主要微生物類群且豐富度大于1%的細(xì)菌種類包括葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、未分類A屬和B屬;相對豐富度大于1%的真菌種類包括曲霉屬和接合酵母屬。