蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽對細菌群落積累量的影響

魏振勇,王嚴,遲雪梅,孫全敏,遲乃玉,張慶芳*

(1.大連大學 生命健康學院,遼寧 大連 116622;2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116622)

亞硝酸鹽是蔬菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的潛在強致癌物,存在潛在的食品安全問題,也被用作著色劑廣泛應用于肉類工業(yè),同時可防止肉毒桿菌等食源性致病菌的生長[1]。攝入大量亞硝酸鹽會引起高鐵血紅蛋白癥和急性中毒,并導致人體出現(xiàn)心跳過速、血脂下降等癥狀,還可與體內(nèi)的仲胺生成致癌性極強的亞硝基化合物,出現(xiàn)致癌風險[2]。隨著種植方法的改變與農(nóng)業(yè)氮肥使用量的增加,硝酸鹽在蔬菜中積累,并在發(fā)酵過程中被硝酸鹽還原細菌(例如腸桿菌)還原為亞硝酸鹽[3],因此,發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的含量及其安全性受到廣泛關(guān)注。根據(jù)研究,亞硝酸鹽在食品發(fā)酵過程中能抑制各種食源性致病菌的生長[4]。

在一個發(fā)酵過程中,微生物數(shù)量龐大,菌群結(jié)構(gòu)復雜多變。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法是獲得生物群落信息最簡單的方法,但有著很大的局限性,特別是因不可培養(yǎng)特性的微生物的存在,低估了微生物的豐度和多樣性,因此采用Sanger測序和PCR-RFLP等方法對其鑒定和分類已經(jīng)成為主要的研究熱點[5]。其中高通量測序(HTS)技術(shù)因不僅具有高通量、高覆蓋、高準確率等特點,而且可全面地揭示樣本微生物群落的組成及多樣性等信息,已被廣泛應用于微生物群落的研究[6]。根據(jù)目前在蔬菜發(fā)酵中利用高通量測序技術(shù)對微生物群落的相關(guān)性研究大多圍繞細菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析[7]、發(fā)酵蔬菜中微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)分析[8-10],并利用相對豐度值對發(fā)酵中的優(yōu)勢菌屬進行闡述。了解某些細菌類群的豐度變化對發(fā)酵食品的生物學研究具有重要意義,然而目前常用的高通量測序技術(shù)只能得到微生物群落結(jié)構(gòu)的物種種類和相對豐度[11],而對相對豐度的分析忽略了不同樣本之間總體微生物量存在的現(xiàn)實差異,也不能反映微生物群落數(shù)量和類群間樣品的差異[12],造成了分析結(jié)果的偏差。有研究表明[13]微生物某一類群相對豐度比例的增加不一定真正與相應微生物類群的生長有關(guān),可能是其他微生物類群的衰退導致其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例增長。說明對微生物群落結(jié)構(gòu)的分析不能僅僅考慮微生物的相對豐度,應該同時考慮微生物的總量。

基于以上因素,本研究以自然發(fā)酵與添加亞硝酸鹽發(fā)酵為研究對象,監(jiān)測發(fā)酵過程中的理化指標、OD600 nm值及相關(guān)細菌總數(shù)的變化,選取理化指標變化明顯的4個發(fā)酵時間點和最終發(fā)酵時間15 d進行16S rRNA高通量測序,將相對豐度與發(fā)酵過程中測定的OD600 nm值的結(jié)合量化成為發(fā)酵過程中細菌群落的積累量,深入分析在蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽對細菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響,為蔬菜發(fā)酵菌劑的選擇提供一定的基礎(chǔ),并提供一種可在一定程度上減少只參考高通量測序菌屬相對豐度帶來的偏差的方法,對未來蔬菜發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)研究中采用高通量相對豐度開展相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)變化的分析具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

大白菜、食鹽:遼寧省大連市大連大學服務中心超市;亞硝酸鈉:上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 實驗試劑

硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;DP812 土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;CRY-2112型恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Thermo Multiskan 1510型酶標儀 芬蘭Labsystems公司;AL204型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 自然發(fā)酵

選取優(yōu)質(zhì)實心大白菜,去除壞葉后用自來水清洗干凈并瀝干表面水分;將白菜切成0.5～1 cm的均勻細絲,將切好的白菜細絲混勻;選用統(tǒng)一規(guī)格的555 mL小型發(fā)酵瓶若干瓶,每瓶裝入160 g白菜絲(經(jīng)前期實驗所得160 g/555 mL白菜絲實驗效果最佳);注入1.5%的鹽水至滿瓶,擰緊瓶蓋,將全部酸菜置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.2 添加亞硝酸鹽發(fā)酵

選取優(yōu)質(zhì)實心大白菜,去除壞葉后用自來水清洗干凈并瀝干表面水分;將白菜切成0.5～1 cm的均勻細絲,注意將切好的白菜細絲混勻;選用統(tǒng)一規(guī)格的555 mL小型發(fā)酵瓶若干瓶,每瓶裝入160 g白菜絲并添加亞硝酸鈉(100 mg/L);注入1.5%的鹽水至滿瓶,擰緊瓶蓋,將全部酸菜放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.3 取樣

將自然發(fā)酵體系記為S體系,添加亞硝酸鈉為Y體系。每瓶酸菜代表不同發(fā)酵時間點的獨立發(fā)酵體系,酸菜發(fā)酵液作為研究對象,每隔12 h取出1瓶發(fā)酵菜進行理化指標(pH、NIT、TAN)及OD600 nm值的測定,至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.4 指標測定

OD600 nm值測定:采用紫外分光光度計測定樣品的吸光度,吸取適量酸菜發(fā)酵液于2 cm無菌比色杯中,用零管調(diào)節(jié)零點,以蒸餾水作為空白對照,在600 nm的紫外波長下測量吸光度。

pH測定:使用pH計對酸菜發(fā)酵液進行測定。

總酸測定:參照 GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[14]。

亞硝酸鹽測定:參照 GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[15]中的鹽酸萘乙二胺法測定。

細菌總數(shù)測定:參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[16]的方法,以上每個樣品均3次重復。

1.3.5 16S rRNA高通量測序

根據(jù)對兩個發(fā)酵體系的理化指標及OD600 nm值的分析,選取具有明顯變化的5個時間點的酸菜樣本,S體系分別標記為S1、S2、S3、S4、S5;Y體系分別標記為YS1、YS2、YS3、YS4、YS5;每個酸菜樣本3個重復。最后將選出的樣本進行16S rRNA高通量測序。按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本的DNA,以其為模板,采用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTA-AT-3′)進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物委托北京百邁客生物科技有限公司完成建庫測序。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2021和Excel 2016對監(jiān)測的指標進行分析和統(tǒng)計。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中OD600 nm值的變化

由圖1可知,添加亞硝酸鹽發(fā)酵與自然發(fā)酵相比,在發(fā)酵相同時間點其OD600 nm值低于自然發(fā)酵,說明亞硝酸鹽可能抑制微生物的生長,進而影響菌群濃度。

圖1 發(fā)酵樣品OD600 nm值Fig.1 OD600 nm values of fermented samples

2.2 理化指標

發(fā)酵過程中的pH值、總酸含量和亞硝酸鹽含量變化情況見圖2。

圖2 發(fā)酵樣品不同時間點的理化指標Fig.2 Physicochemical indexes of fermented samples at different time points

由圖2可知,發(fā)酵25 h時,S體系的pH值由5.45降至3.92,Y體系的pH值由5.97降至4.51,下降趨勢劇烈,此時S體系中亞硝酸鹽含量達到“亞硝峰”(32.63 mg/L),Y體系中亞硝酸鹽含量在25～37 h降解迅速,在37 h時降解率達到54.48%。在73 h時,S體系與Y體系的pH值均小于4.0。

2.3 發(fā)酵體系中細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

pH值是評價蔬菜發(fā)酵程度的重要指標,下降速度越快,表明蔬菜進入發(fā)酵時間越早,酸菜成熟速度也越快[17]。以pH值為主要變化指標,選取1,13,25,73 h和最終發(fā)酵時間15 d的樣品進行高通量測序。

S體系與Y體系中各發(fā)酵時間點細菌菌群各分類水平見表1。

表1 樣品物種數(shù)目Table 1 Number of sample species

由表1可知,兩體系共含有13個門,142個屬,體系間物種數(shù)目差異不大,發(fā)現(xiàn)添加亞硝酸鹽對發(fā)酵前后期物種數(shù)目的影響不大。

2.3.1 門水平細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平菌群結(jié)構(gòu)見圖3。體系間相對豐度排名前五的菌門中,共有菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍藻細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。在S體系中,相對豐度值大小為厚壁菌門>變形菌門>藍藻細菌門>擬桿菌門;在Y體系中,相對豐度值大小為厚壁菌門>藍藻細菌門>變形菌門>擬桿菌門。根據(jù)體系間對比,Y體系中厚壁菌門的相對豐度是S體系的1.27倍,藍藻細菌門是S體系的1.58倍,擬桿菌門是S體系的1.04倍;S體系中變形菌門的相對豐度是Y體系的2.66倍。

圖3 門水平發(fā)酵樣本(A)與體系(B)細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of bacterial community of fermented sample (A) and system (B) at the phylum level

2.3.2 屬水平細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

屬水平菌群結(jié)構(gòu)見圖4。兩體系間排名前十的菌屬為uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、乳球菌屬(Lactococcus)、uncultured_bacterium_o_Chloroplast、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、Brassica_napus_rape、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、異樣根瘤菌屬(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)。均有Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus3種乳酸菌菌屬。在S體系中,乳酸菌屬的相對豐度值大小為Lactococcus>Lactobacillus>Leuconostoc;在Y體系中,乳酸菌屬的相對豐度值大小為Lactococcus>Leuconostoc>Lactobacillus。體系間對比,Y體系中Lactococcus的相對豐度是S體系的1.96倍;S體系中Lactobacillus的相對豐度是Y體系的185.88倍;兩體系間Leuconostoc的相對豐度值一致(7.21%)。對比排名前十的有害菌屬,S體系中uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對豐度是Y體系的30.39倍,Chryseobacterium的相對豐度是Y體系的1.13倍。

圖4 屬水平發(fā)酵樣本(A)與體系(B)菌群結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of bacterial community of fermented sample (A) and system (B) at the genus level

2.4 發(fā)酵過程中細菌總數(shù)變化

由于Y體系OD600 nm值在發(fā)酵過程中始終低于S體系,因此進一步分析細菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)數(shù)量變化,結(jié)果見圖5。Y體系在發(fā)酵過程中細菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)始終低于S體系,說明亞硝酸鹽抑制了發(fā)酵過程中某些微生物的生長。

圖5 發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化Fig.5 Change of microbial quantity in fermentation process

2.5 發(fā)酵體系中群落積累量變化與相對豐度的關(guān)系

只利用高通量測序結(jié)果中的相對豐度變化來分析微生物群落的相應變化,忽略了各樣本之間的微生物總數(shù),使得最后的結(jié)果存在一定的偏差。為了修正相對豐度帶來的偏差,利用OD600 nm值來測定微生物在某個時間點的菌體濃度作為該點樣本中微生物的相對總數(shù),并與高通量測得的各個物種的相對豐度相乘得出更準確的各個物種的相對數(shù)量(見圖6)。餅圖面積表示各樣本的OD600 nm值,面積逐漸增大,表示菌群數(shù)量逐漸增多;各物種的積累量為所代表物種的相對豐度與OD600 nm值的乘積,即所占餅圖的面積,從而可看出各個發(fā)酵時間點上物種積累量的變化。

圖6 發(fā)酵樣本門水平菌群數(shù)量變化Fig.6 Change of bacterial community of fermented samples at the phylum level

2.5.1 門水平變化分析

門水平上,各菌門在發(fā)酵過程中的積累量變化見圖6,根據(jù)餅圖大小變化,Y體系中各個發(fā)酵時間點餅圖面積始終小于S體系中各個發(fā)酵時間點,且兩體系隨著發(fā)酵時間延長餅圖面積逐漸增大,即各樣品中微生物總數(shù)也在逐漸增多。

由圖7和圖8可知,S體系中變形菌門的相對豐度在S5階段下降,但其積累量在發(fā)酵過程中始終呈上升趨勢,藍藻細菌門在S3～S5階段呈下降趨勢,但其積累量在該階段始終呈上升趨勢;說明相對豐度的降低并不能表示其菌門的積累量也減少。Y體系中厚壁菌門在YS3與YS4階段相對豐度相差不明顯(2.05%),但YS4階段的積累量是YS3階段的2.44倍,說明相對豐度變化不大的階段不能表示其菌門數(shù)量也沒有較大變化。在S體系中,變形菌門的積累量始終呈上升趨勢,最大積累量為27.61%,而Y體系中變形菌門的積累量始終沒有較大波動,最大積累量為1.51%,說明亞硝酸鹽對變形菌門的生長有明顯抑制作用。厚壁菌門在S3階段的相對豐度是S2的2.29倍,YS3是YS2的15.06倍,但積累量S3是S2的7.15倍,YS3是YS2的36.89倍;藍藻細菌門在S1階段的相對豐度是S2的18.19倍,YS1是YS2的1.81倍,但積累量S1是S2的11.61倍,YS1是YS2的1.77倍;綜上,說明相對豐度的上升或下降比例不能完全說明該菌門數(shù)量也呈現(xiàn)相同比例的增加或減少。

圖7 發(fā)酵體系菌門相對豐度Fig.7 Relative abundance of bacterial phylum of fermented system

圖8 發(fā)酵體系菌門積累量Fig.8 Accumulation amount of bacterial phylum of fermented system

2.5.2 屬水平變化分析

屬水平上,各菌屬在發(fā)酵過程中的積累量變化見圖9。

圖9 發(fā)酵樣本屬水平菌群數(shù)量變化

在S體系中,Lactococcus、Leuconostoc在發(fā)酵過程中相對豐度均呈先上升后下降的趨勢,但其積累量始終呈上升趨勢;在S3～S5的發(fā)酵過程中其相對豐度值始終低于Y體系中的YS3～YS5階段,其積累量也低于Y體系中的YS3～YS5階段。

在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的有害菌屬,Y體系中的相對豐度低于S體系,根據(jù)積累量比較,uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Enterococcus、Serratia在Y體系中各發(fā)酵階段的積累量低于S體系,如uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae在YS1(0%)階段低于S1(0.01%),在YS2(0.02%)低于S2(1.93%),在YS3(0.15%)低于S3(7.63%),在YS4(0.53%)低于S4(17.14%),在YS5(0.33%)低于S5(20.09%),說明亞硝酸鹽可抑制有害菌的生長。

3 結(jié)果與討論

通過高通量測序技術(shù)檢測到的相對豐度變化不能準確地反映實際分類單元密度的動態(tài)[13]。因不同樣本之間總體微生物量存在現(xiàn)實差異,所以將相應的相對豐度與OD600 nm值結(jié)合,量化微生物的類群總量,是深入分析環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要前提。而微生物總量是微生物學的一項基本指標,對其進行測定往往很繁瑣、費時[18]。考慮到這一因素,本研究采用分光光度計對微生物的OD600 nm值進行測定,其具有簡便、迅速、可連續(xù)測定、適合自動控制等優(yōu)點;且與微生物的總數(shù)變化呈正相關(guān);又有與高通量測序中死菌、活菌一起測定的性質(zhì)。通過將高通量測序方法得到的相對豐度與測定的OD600 nm值相結(jié)合,來計算相應菌屬的微生物積累量,進一步對蔬菜發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)變化進行分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在門水平上,S體系中變形菌門的相對豐度在S5階段下降,但其積累量在發(fā)酵過程中始終呈上升趨勢;藍藻細菌門在S3～S5階段呈下降趨勢,但其積累量在該階段始終呈上升趨勢。Y體系中厚壁菌門在YS3與YS4階段相對豐度相差不明顯(2.05%),但YS4的積累量是YS3的2.44倍。厚壁菌門在S3階段的相對豐度是S2的2.29倍,YS3是YS2的15.06倍,但積累量S3是S2的7.15倍,YS3是YS2的36.89倍;藍藻細菌門在S1階段的相對豐度是S2的18.19倍,YS1是YS2的1.81倍,但積累量S1是S2的11.61倍,YS1是YS2的1.77倍。表明只參考相對豐度帶來的結(jié)果并不能準確地反映發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,同時菌屬相對豐度的降低并不能代表其菌屬總數(shù)的減少;當菌屬相對豐度值沒有明顯波動時也不能表示其菌屬微生物總數(shù)也沒有波動;同時相對豐度的上升或下降比例不能完全說明該菌門數(shù)量也呈現(xiàn)相同比例的增加或減少。進而表明在利用高通量測序?qū)ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)變化進行分析時,不能僅僅考慮微生物的相對豐度,應該同時考慮微生物的總量。

對蔬菜發(fā)酵的研究中,關(guān)于亞硝酸鹽問題早已成為蔬菜發(fā)酵研究的熱點之一。在發(fā)酵過程中,不僅微生物群落會受到各種因素的影響,亞硝酸鹽含量也會產(chǎn)生相應的變化,研究亞硝酸鹽與發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系,以確定發(fā)酵過程中的核心微生物,對最佳發(fā)酵劑的選擇具有重要意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),門水平上,S體系中變形菌門的積累量始終呈上升趨勢且最大積累量為27.61%,而Y體系中變形菌門的積累量始終沒有較大波動,最大積累量為1.51%,說明亞硝酸鹽對變形菌門的生長有明顯抑制作用。屬水平上,兩體系發(fā)酵過程中有害菌屬的相對豐度值與積累量表明亞硝酸鹽可抑制有害菌的生長。相對豐度與積累量顯示,在發(fā)酵過程中,S體系中Lactococcus、Leuconostoc為發(fā)酵前期主要優(yōu)勢乳酸菌屬,Lactobacillus為發(fā)酵末期主要優(yōu)勢乳酸菌菌屬;Y體系中Lactococcus、Leuconostoc參與整個發(fā)酵過程,并以Lactococcus為優(yōu)勢乳酸菌菌屬。在Y體系中,亞硝酸鹽一直處于降解狀態(tài),在發(fā)酵前期pH大于4.5時,乳酸菌產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物(如亞硝酸還原酶),此時亞硝酸鹽降解以酶降解為主[19-20];在發(fā)酵后期發(fā)酵環(huán)境中pH不斷降低,H+與亞硝酸鹽發(fā)生非酶歧化反應,亞硝酸鹽的降解由酶降解轉(zhuǎn)為酸降解[20];在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種氨基酸,亞硝酸能與含游離α-氨基的氨基酸發(fā)生反應[21],進而降低其含量;同時發(fā)酵體系中的反硝化細菌含有亞硝酸鹽還原酶,可通過好氧或厭氧反硝化過程將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成一氧化二氮或氮氣[22],從而降低亞硝酸鹽含量。最后本研究中亞硝酸鹽對發(fā)酵過程中的微生物量有一定的影響,對蔬菜發(fā)酵劑的進一步選擇與發(fā)酵工藝的改進有一定的參考意義。