苧麻種質基因型對體細胞植株再生的影響

何鵬亮，蔣美艷，邢虎成，揭雨成*

(1 湖南農業大學苧麻研究所，湖南 長沙 410128； 2 湖南省草類作物種質創新與利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128)

苧麻(Boehmeria nivea)為蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)的多年生草本植物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區，在世界上享有“中國草”(China grass)之譽稱[1-3]。 其栽培歷史在4 000 年以上，是我國最先利用的天然纖維之一[4]。 苧麻組織培養技術在苧麻品種改良、種質資源的繁殖和保存、雜種優勢的固定和遺傳轉化等方面具有重要作用。 高再生率的體細胞再生體系對開展體細胞無性系變異規律研究及其種質創新極為有利。 迄今為止，苧麻離體再生體系的研究已取得了一定的進展，研究內容涉及基因型[5-10]、激素[11-16]、外植體類型[17-19]、基本培養基[8，20-21]等，但仍存在基因型差異顯著、植株再生頻率低、可重復操作性差等問題。 本試驗研究苧麻種質基因型對體細胞植株再生的影響，以為苧麻的組織培養及植株再生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用6 個苧麻種質，分別是湘飼苧X4、湘飼苧X6、湘飼苧X7、A、B 和C，均由湖南農業大學苧麻研究所提供。

1.2 試驗方法

將6 個苧麻種質種苗移栽于裝有營養土的盆中進行培養，等植株長出新葉后，取嫩葉作為外植體，每個種質各接種30 片，3 個重復共90 片，用毛筆輕輕刷去雜質，用自來水沖洗，濾紙吸干，在超凈工作臺上用75%酒精浸洗25 s 后，用無菌水沖洗3 遍，再用0.1%升汞消毒7 min，用無菌水沖洗5 遍后，在無菌濾紙上將葉片切成0.5 cm×0.5 cm 的方塊，并將其接種于愈傷組織誘導培養基上。 將葉塊的下表皮貼于培養基上，于暗室中誘導愈傷組織，一般5 d后愈傷基本形成。 10 d 后將愈傷轉接于不定芽誘導培養基上，培養條件:白天溫度26±2 ℃，夜間為20±2 ℃，每天光照11 h，光照強度為1 500 ～2 000 Lx。 愈傷組織通過多次繼代，分化出不定芽，再將不定芽轉接在壯苗培養基上壯苗，待不定芽長至2 ～3 cm 時，再將其轉接于生根培養基中，10 d 后可以長出新根，即為完整的再生植株。 愈傷組織、不定芽和根的誘導均設3 次重復。

1.3 培養基配方

愈傷組織誘導培養基:MS 培養基＋TDZ(噻苯隆，0.05 mg/L)＋2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，0.03 mg/L)＋IAA(吲哚乙酸，0.01 mg/L)。

不定芽誘導培養基:1/2 MS 培養基＋TDZ(0.5 mg/L)＋2，4-D(0.02 mg/L)＋IAA(0.03 mg/L)。

壯苗培養基:MS＋TDZ(0.05 mg/L)＋IAA(0.05 mg/L)。

生根培養基:MS＋TDZ(0.02 mg/L)＋NAA(0.05 mg/L)＋IAA(0.02 mg/L)。

1.4 數據處理及方法

采用Excel 2010 對數據進行初步整理，用DPS 9.01 軟件進行方差分析。 本研究根據以下公式計算組織培養處理的愈傷組織誘導率、不定芽誘導率和生根率[22]:

愈傷組織誘導率(%)＝(產生愈傷組織的葉片數/接種的葉片數)×100；

不定芽誘導率(%)＝(產生不定芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織塊數)×100；

生根率(%)＝(生根小苗數/接種的不定芽數)×100。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導

6 個苧麻種質愈傷組織的誘導結果見表1 和圖1。 在時間上，種質A、B 和C 在接種后第2 天葉片出現膨大，第3 天誘導出愈傷組織，湘飼苧X4 在第5 天出現愈傷組織，湘飼苧X6 和湘飼苧X7 脫分化的時間最長，第7 天才誘導出愈傷組織，且長出的愈傷組織不整齊。 顏色上，A、B 和C 分別出現了米白、淺黃和淡紅等顏色，其他3 個種質的愈傷組織顏色較一致。 在愈傷組織的質量上，A、B 和C 的愈傷組織長勢相對較強，質地疏松，成小瘤、顆粒狀，且愈傷組織誘導率也較高，其中，C 的愈傷誘導率最高，達96.67%，A 和B 的愈傷誘導率均為90.00%；湘飼苧X6 和湘飼苧X7 的愈傷組織長勢較弱，尤其是湘飼苧X7，愈傷組織質地呈蓬松狀，少量的愈傷還出現了變褐現象，其愈傷組織誘導率最低，為30.00%，湘飼苧X6 為40.00%；湘飼苧X4 的愈傷組織誘導率為76.67%，處于中間位置，高于湘飼苧X6 和湘飼苧X7，但低于A、B 和C。

圖1 不同苧麻種質培養15 d 的愈傷組織Fig.1 Callus of different ramie germplasm cultured for 15 days

表1 不同苧麻種質愈傷組織的誘導結果Table 1 Callus induction results of different ramie germplasm

2.2 不定芽誘導

將6 個種質的愈傷組織轉接在不定芽誘導培養基上，每隔3 d 觀察1 次，每隔3 個星期繼代1 次，觀察并記錄結果(表2，圖2)。 根據表2，第1 次繼代后，每個種質都出現了不同程度的變褐現象，其中湘飼苧X4、湘飼苧X6 和湘飼苧X7 較嚴重，變褐的愈傷組織最后都出現死亡的現象，嚴重影響了不定芽誘導率；湘飼苧X4、湘飼苧X6 和湘飼苧X7 的不定芽誘導率分別為11.62%、8.33%、5.88%；種質A、B、C 的情況較好，特別是種質C。 第2 次繼代后，愈傷組織分化出了少量的芽和簇芽，其中B 有15塊愈傷分化出了根，A 的愈傷轉綠，質地致密。 第3次繼代后，A 和B 均分化出了芽，由于B 分化了根，不利于芽和苗的再生，A 的不定芽誘導率(24.52%)稍高于B(21.15%)，不定芽誘導率最高的是種質C(31.57%)。

圖2 不同苧麻種質愈傷組織9 周后誘導出的不定芽Fig.2 Adventitious buds induced from callus of different ramie germplasm after 9 weeks

圖3 不同苧麻種質的不定芽生根情況(轉接至生根培養基后17 d)Fig.3 Rooting of adventitious buds in different ramie germplasm (17 days after transfer to rooting medium)

表2 不同苧麻種質不定芽誘導結果Table 2 Induction of adventitious buds from different ramie germplasm

2.3 壯苗培養情況

由于愈傷組織上長出來的不定芽太小，生長能力弱，不能直接接種在生根培養基中生根，而需要在壯苗培養基中繼續培養壯苗。 即將誘導出不定芽的愈傷塊轉接在附加TDZ(0.05 mg/L)和IAA(0.05 mg/L)的MS 培養基中，每隔3 d 觀察1 次，15 d 后觀察發現，大部分不定芽生長較好，莖稈粗，葉子蔥綠，也有少許不定芽生長較慢，芽苗較矮，葉子較小。

2.4 根的誘導

待不定芽長至2 ～3 cm，將其轉接在附加TDZ(0.02 mg/L)、IAA(0.02 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS 培養基上，10 d 后，6 個種質全部生根。 開始根少且短，植株矮小，1 周后，整個三角瓶的底部都布滿了根，植株也隨著長高長大，從而形成了完整的再生植株。

3 討論

潘昌立等[5]研究發現，基因型是苧麻外植體誘導愈傷組織和再生植株的決定因素，在相同培養條件下，不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導率表現為:湘苧6 號(36.0%)＞湘苧2 號(34.0%)＞Q8(20.0%)＞蘆竹青(8.8%)＞湘苧3 號(3.3%)＞C5(2.9%)。 劉瑛等[6]研究發現，基因型和培養基組分是影響苧麻體細胞植株再生的內因和主要外因，不同基因型苧麻葉愈傷組織的綠芽誘導率表現為:細野麻(36.0%)＞贛苧3 號(33.4%)＞湘苧2 號(32.0%)＞89-12(20.0%)＞湘苧3 號(3.3%)。 馬雄風[7]研究發現，在相同培養條件下，不同基因型苧麻下胚軸愈傷的芽再生頻率表現為:中飼苧1 號(83.77%)＞中苧1 號(81.77%)＞NC01(80.59%)；子葉愈傷組織的芽再生頻率表現為:NC01(60.29%)＞中苧1 號(57.14%)＞中飼苧1 號(50.51%)。

王曉玲等[8]將湘苧6 號和湘苧2 號的葉片在附加2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS、MSB、LS、B5 和N6 等5 種培養基上進行培養，發現湘苧2號葉愈傷組織量均高于湘苧6 號。 王曉玲和彭定祥[9]研究發現，在附加0.5 ～2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA，0.5-2.5 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L 2，4-D 的MS 培養基上進行培養，黃殼早、湘苧2 號、華苧3 號和巴西麻6 號適應性強，脫分化和分化均較容易，但華苧1 號脫分化難。 Wang 等[10]研究發現，苧麻不定芽再生情況取決于基因型，將6 種苧麻基因型在附加2.27 μM TDZ 和0.057 μM IAA 或2.27 μM TDZ 和0.054 μM NAA 的MS 培養基上培養，5041-3 的不定芽誘導率最高，分別為86.2%和64.5%，黃皮棍的不定芽誘導率最低，分別為46.5%和33.4%。

4 結論

本研究中，6 個苧麻種質的愈傷誘導率均較高，種質C 的愈傷誘導率最高，達96.67%，湘飼苧X7的愈傷誘導率最低，為30.00%；而6 個種質的不定芽誘導率卻相對較低，種質C 的不定芽誘導率最高，為31.57%，湘飼苧X7 的不定芽誘導率最低，僅為5.88%。 綜合分析，基因型是影響苧麻外植體愈傷組織誘導和不定芽形成的重要因素。