汗孔角化癥三例散發(fā)患者基因突變分析

侴夢(mèng)微 郝陽陽 連煒煒 陳 茜 楊建強(qiáng)

湖州市第一人民醫(yī)院皮膚科,浙江湖州,313000

汗孔角化癥(porokeratosis,PK)是一種少見的遺傳異質(zhì)性疾病,多為常染色體顯性遺傳,以具有堤狀邊緣隆起的萎縮性斑塊或斑塊為特征,稱為角狀板層［1-3］。根據(jù)皮損大小、部位、數(shù)量等可分為斑塊型汗孔角化癥、淺表播散型汗孔角化癥、光化性播散性淺表性汗孔角化癥、角化過度型汗孔角化癥、線性汗孔角化癥等多種類型。汗孔角化癥確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可能與MVK、MVD、PMVK、FDPS、SSH1、ARPC3、SLC17A9、SART3共8個(gè)基因的突變有關(guān),紫外線照射和免疫抑制、藥物、感染、創(chuàng)傷等可誘發(fā)或加重本病［2-4］。本研究針對(duì)3例汗孔角化癥患者進(jìn)行基因檢測(cè)分析突變基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者1,女,34歲,面部散在環(huán)狀褐色斑塊(圖1a)10余年,診斷為斑塊型汗孔角化癥。患者2,男,54歲,患者兒時(shí)起軀干即出現(xiàn)散在圓形或類圓形褐色斑塊(圖1b、1c),逐漸累及軀干、面部、四肢,診斷為播散性淺表性汗孔角化癥。患者3,女,21歲,四肢等暴露部位散在環(huán)形皮損(圖1d)5年,診斷為光化性播散性淺表性汗孔角化癥。診斷均經(jīng)臨床和組織病理、皮膚鏡檢查確診(圖2、3)。患者1、2無其他系統(tǒng)疾病,患者3合并銀屑病(輕度,外用藥物控制可,未經(jīng)紫外線光療)。3例患者為散發(fā)病例,直系親屬未發(fā)現(xiàn)汗孔角化癥。本研究均經(jīng)患者知情同意。

1a:患者1面部散在環(huán)狀褐色斑塊;1b、1c:患者2軀干散在圓形或類圓形褐色斑塊;1d:患者3下肢散在環(huán)形皮損

圖2 局灶鱗狀上皮細(xì)胞角化不全柱,角化不良細(xì)胞,真皮淺層慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(HE,×100) 圖3 皮膚鏡(偏振模式,×50) 3a～3c:均可見雙軌征;3a、3b:黑褐色色素顆粒沿皮損邊緣分布

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集患者外周血5 mL進(jìn)行基因組DNA提取,基因組DNA經(jīng)Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為150～250 bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端連接上Y字型接頭制備成DNA文庫。帶有不同index標(biāo)記的DNA文庫pooling后與帶有生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交,然后用包被有鏈霉親和素的磁珠將待測(cè)基因的全部外顯子捕獲下來,經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢,合格的文庫即可進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.2 探針設(shè)計(jì)與合成 使用的探針由羅氏合成,平均測(cè)序深度達(dá)100×以上,Q30>90%。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析與解讀 使用BWA、Samtools和Picard軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類參考基因組(GRCh37/hg19)。生成的bam文件采用GATK系列軟件進(jìn)行局部重新比對(duì),去除重復(fù)序列后檢出變異,使用Annovar對(duì)vcf變異文件進(jìn)行變異注釋。致病變異篩選:(1)篩選出ExAC_EAS、1000Genomes等數(shù)據(jù)庫中未見正常人攜帶或攜帶率小于1%的變異;(2)篩選出編碼區(qū)上的非同義突變、剪接突變等;(3)參考dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多種數(shù)據(jù)庫對(duì)變異位點(diǎn)的評(píng)估;(4)參考Scsnv、Revel等軟件對(duì)變異位點(diǎn)的預(yù)測(cè);(5)參考SIFT、LRT、Polyphen2、FATHMM和MutationTaster等軟件對(duì)變異導(dǎo)致蛋白功能改變的預(yù)測(cè);(6)結(jié)合先證者的表型根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南進(jìn)行變異篩選。

1.2.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 針對(duì)篩選到的與先證者表型相符的變異位點(diǎn),設(shè)計(jì)PCR引物,擴(kuò)增目的片段測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

三例患者均檢測(cè)MVD基因雜合突變。患者1 MVD基因錯(cuò)義突變(c.875A>G)導(dǎo)致肽鏈第292個(gè)氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸(p.Asn292Ser)。患者2 MVD基因錯(cuò)義突變(c.746 T>C)導(dǎo)致肽鏈第249個(gè)氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸(p.Phe249Ser)。患者3 MVD基因錯(cuò)義突變(c.746 T>C)導(dǎo)致肽鏈第249個(gè)氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸(p.Phe249Ser),同患者2。3例患者突變基因及位點(diǎn)均為已報(bào)道PK致病基因及位點(diǎn),未檢測(cè)到其他PK相關(guān)致病基因(圖4)。

圖4 4a: 錯(cuò)義突變(c.875A>G,p.Asn292Ser);4b:錯(cuò)義突變(c.746 T>C,p.Phe249Ser);4c:錯(cuò)義突變(c.746 T>C,p.Phe249Ser)

3 討論

汗孔角化癥(porokeratosis,PK)是一種具有常染色體顯性遺傳傾向的少見皮膚病,累及小汗腺［5］。PK在男性中更常見,皮損可累及周身任何部位(黏膜受累罕見)［5］。根據(jù)PK臨床表現(xiàn)和累及部位等不同,可分為多種臨床分型。包括經(jīng)典型(Mibelli型汗孔角化癥、淺表播散型PK、光化性淺表播散型PK、線狀型PK、點(diǎn)狀型PK、掌跖泛發(fā)性型PK)和非經(jīng)典型(巨大汗孔角化癥、播散性發(fā)疹型PK、疣狀汗孔角化癥、日光性面部汗孔角化癥、汗孔角化瘤)［6］。

汗孔角化癥的發(fā)病機(jī)制目前多認(rèn)為與局部和全身的免疫抑制導(dǎo)致免疫監(jiān)視的減少有關(guān),還有角質(zhì)形成細(xì)胞異常凋亡［5］。先天性或獲得性免疫缺陷、器官移植、丙型肝炎、肝功能衰竭、慢性腎功能衰竭和其他與免疫抑制相關(guān)的疾病,生物療法、光療(紫外線照射)、放化療都和PK的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［2,7］。光療多導(dǎo)致光線性淺表播散型PK［2］,光療也是銀屑病的一種治療方法。國(guó)內(nèi)外均有PK合并銀屑病的報(bào)道,PK和銀屑病可以同時(shí)或先后出現(xiàn),本文中患者3就是先患銀屑病,后出現(xiàn)PK。PK與銀屑病發(fā)病機(jī)制有一定相關(guān)性,過度增殖的角蛋白mRNAs(16、6A、6B和17)、S-100鈣結(jié)合蛋白(A7-A11)和縫隙連接蛋白(連接蛋白26和30)均在兩種疾病中表達(dá)上調(diào)［2,8］。

隨著致病基因研究的深入,發(fā)現(xiàn)8個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致PK發(fā)生,包括甲羥戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMVK)、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(FDPS)、5 焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物 3(ARPC3)、彈弓蛋白磷酸絲切酶(SSH1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SART3)和溶質(zhì)運(yùn)載蛋白家族 17 中第 9 成員(SLC17A9)［9,10］。最新研究發(fā)現(xiàn)PK患者存在HMGCR基因突變,提示甲羥戊酸代謝途徑上的所有基因均可能(MVK、PMVK、MVD、FDPS、HMGCR)與PK有關(guān)［11］。

MVD基因編碼甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶,位于染色體16q24.3。MVD突變導(dǎo)致的PK 皮損直徑小于2 cm,年齡跨度大(發(fā)病年齡5～70歲),可特異性表現(xiàn)為日光性面部汗孔角化癥［6］。c.875A>G和c.746T>C是 MVD 中的熱點(diǎn)突變 ,c.746T>C為最常見的突變［3,4,9］。有報(bào)道MVD突變 c.746T>C (p.Phe249Ser) 存在不完全外顯率,這提示特定的觸發(fā)因素,如MVD突變的二次打擊可能是汗孔角化癥發(fā)作所必需的［1,3］。

本研究3例PK患者均為MVD基因突變。患者1為MVD基因錯(cuò)義突變(c.875A>G);患者2、患者3均為MVD基因錯(cuò)義突變(c.746 T>C)。再次驗(yàn)證了這兩個(gè)突變位點(diǎn)為MVD基因中的熱點(diǎn)突變。MVD突變導(dǎo)致的PK患者年齡范圍很大,本研究中患者年齡為21～54歲,也符合這一特點(diǎn)。

基因型與臨床表型有一定關(guān)系。30%～50%MVK突變PK患者表現(xiàn)為巨大斑塊型疣狀PK,MVK突變患者的皮損數(shù)量和面積最多,FDPS突變患者一般皮損數(shù)量大于500個(gè),直徑小于1 cm,既往認(rèn)為生殖器部位的PK僅與PMVK有關(guān),但有研究報(bào)道MVK、FDPS突變也可表現(xiàn)為生殖器PK［9,11］。目前依據(jù)已知的突變基因或區(qū)域在在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM數(shù)據(jù)庫)中將PK分為9個(gè)基因型［10］,每一型可有不同臨床表型。MVD目前被報(bào)道有10種突變位點(diǎn)(c.875A>G、c.746T>C、c. 302C>G、c. 383C>T、c. 482G>T、c. 678 + 1G>T等),臨床表型可相同或不同［12］。本研究中患者2和患者3突變基因及位點(diǎn)均相同,但臨床表型卻不同,體現(xiàn)了基因多效性。

皮膚鏡也可以用來觀察PK。“雙軌征”是PK的特征性結(jié)構(gòu),即皮損外圍白色至黃色、褐色不等的環(huán)狀角化過度結(jié)構(gòu),對(duì)應(yīng)于臨床上堤狀隆起邊緣和組織病理中的角化不全柱［13,14］。本研究3例患者接受皮膚鏡檢查,均見“雙軌征”,可見黑褐色色素顆粒沿皮損邊緣分布,對(duì)應(yīng)病理中真皮淺層色素改變,與以往報(bào)道相符［13］。

PK作為少見皮膚病,目前對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)上有不足,大部分患者呈常染色體顯性遺傳傾向,可檢測(cè)到突變基因。但臨床中也確有部分PK患者未檢測(cè)到基因突變。可能是致病基因位于非編碼區(qū)或?yàn)楹筇飓@得性免疫抑制所致PK等原因。這都需大樣本的研究。本研究3例患者均為散發(fā)病例,再次驗(yàn)證了MVD是PK的常見突變基因,c.746 T>C、c.875A>G是其熱點(diǎn)突變。有助于今后臨床診斷或遺傳咨詢工作的開展。