遺傳性單純性少毛癥一家系A(chǔ)PCDD1基因突變研究

齊思思 繆 盈 徐 峰 盛友漁 胡瑞銘 趙 俊 周麗娟 楊勤萍

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科,上海,200041

遺傳性單純性少毛癥(hereditary hypotrichosis simplex,HHS)是一組罕見的僅累及毛發(fā),不累及其他系統(tǒng)的先天性遺傳性脫發(fā)疾病,不伴任何毛干形態(tài)異常［1,2］。HHS患者通常出生時毛發(fā)正常,生后幾個月內(nèi)毛發(fā)開始脫落?；颊叩念^發(fā)和體毛稀疏,毛干結(jié)構(gòu)正常。牙齒、指(趾)甲、汗腺及其他外胚葉器官均發(fā)育正常,無毛囊角化,不伴其他系統(tǒng)受累。

HHS分為全身型和局限頭皮型兩種類型。全身型HHS的致病基因包括腺瘤性息肉調(diào)節(jié)蛋白1(adenomatosis polyposis coli down-regulated 1 protein,APCDD1)基因、小核糖核蛋白E(small nuclear ribonucleoprotein E,SNRPE)基因、核糖體蛋白L21(60S ribosomal protein L21,RPL21)基因。頭皮局限型HHS的致病基因為角膜鎖鏈蛋白(corneodesmosin,CDSN)基因［3］。最近有學(xué)者對HHS家系進行全外顯子測序(WES),發(fā)現(xiàn)CDH3基因變異(p.Ser223GlyfsTer4)可能與HHS相關(guān)［4］。

本研究中我們報道了一個5代35人的中國漢族大家系,其中13例HHS患者。基因組DNA測序分析顯示APCDD1基因存在一個已知的雜合突變(C.26T>G,p.Leu9Arg)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 我院皮膚科脫發(fā)專病門診確診的1例HHS患者及其家系成員。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準。經(jīng)知情同意后,采集家系中8例患者及4名非患者外周血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。同時采集100名無親緣關(guān)系的健康人外周血5 mL作為對照。采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京) 提取基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 根據(jù)既往文獻設(shè)計特異性引物［5-8］,通過PCR擴增APCDD1、SNRPE、RPL21及CDSN基因全部外顯子及側(cè)翼序列。20 μL PCR反應(yīng)體系為: PCR taq mix 10 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件: 預(yù)變性94℃ 3 min,變性 94℃ 30 s,退火 55℃～59℃ 30 s,延伸 72℃ 30 s,共進行35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 DNA測序 采用sanger法進行測序,測序平臺ABI 3730xl( Applied Bio-systems,美國)。

1.2.4 突變分析 用DNA Sequencing analysis軟件分析測序結(jié)果,并用Sequencher5.1軟件包進行比對分析。

1.2.5 驗證 按前述方法提取100名健康對照基因組,擴增患者相應(yīng)突變位點進行測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 這是一個5代35人的中國漢族大家系,其中患者13例(圖1)。先證者,女,17歲,漢族。出生時頭發(fā)正常,3個月后開始出現(xiàn)脫發(fā),并隨著年齡的增長逐漸惡化。皮膚科情況:彌漫性頭發(fā)稀疏,體毛、腋毛、陰毛稀疏,眉毛和睫毛正常。全身皮膚、甲、牙齒和眼睛無異常。發(fā)汗正常,智力和體格發(fā)育正常,非綜合征(圖2)。輔助檢查:血常規(guī)、甲狀腺功能、微量元素、抗核抗體均正常。該家系其他患者均有相似表現(xiàn)。

箭頭所示為先證者,星號標記為采集到外周血的個體

2a～2d:彌漫性頭發(fā)稀疏,體毛、腋毛、陰毛稀疏,眉毛和睫毛正常;2e、2f:毛發(fā)鏡檢查見毛干結(jié)構(gòu)正常,毛發(fā)變細,稀疏

我們一共采集家系外周血樣本12例,其中患病個體8例(III代 個體9、11、13、15;IV代 個體1、4、8; V代 個體1),未患病個體4名(III代 個體16;IV代 個體3、7、9),用于基因測序。

2.2 基因分析 我們使用前述的引物和反應(yīng)條件對該家系成員的APCDD1、SNRPE、RPL21及CDSN基因進行了直接測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系患病個體的APCDD1基因中存在一個頻發(fā)性突變C.26T>G, p.Leu9Arg,密碼子CTC變?yōu)镃GC(圖3a～3h),而家系未患病個體和無血緣關(guān)系的中國漢族對照組中未檢測到這種變化(圖3i～3m)。對另外三個基因SNRPE、RPL21及CDSN的序列分析,未能在家系中患病個體或未患病個體中檢測到序列變異。

3 討論

遺傳性少毛癥(hereditary hypotrichosis,HH)是一組罕見的臨床特征,患者通常出生時或生后不久頭皮或身體其他部位毛發(fā)持續(xù)性部分或完全缺失,伴或不伴毛發(fā)結(jié)構(gòu)異常［3］。該病具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性,包括綜合征型和非綜合征型(孤立型)。按遺傳模式可分為常染色體顯性(AD)或常染色體隱性(AR)遺傳,其中ADHH按致病基因分為遺傳性單純性少毛癥(HHS)、Marie Unna遺傳性少毛癥(MUHH)和羊毛狀毛發(fā)(WH)三種類型。

HHS分為全身型(少毛癥1、11、12型)和頭皮局限型(少毛癥2型)。全身型的致病基因有APCDD1 (少毛癥1,MIM 607479)、SNRPE (少毛癥11,MIM 128260)和RPL21 (少毛癥12,MIM 603636)。頭皮局限型的致病基因為CDSN (少毛癥2,MIM 602593);MUHH分為1型和2型,亞型1的致病基因為U2HR (少毛癥4,MIM 146550),亞型2的致病基因為EPS8L3 (少毛癥5,MIM 614989) ;WH是一種角蛋白功能缺陷引起的先天性毛發(fā)結(jié)構(gòu)異常疾病。其致病基因包括KRT74(少毛癥3,MIM 613981)和KRT71(少毛癥13,MIM 615896)。

本研究中我們報道了一個5代35人的中國漢族HHS家系,來自中國浙江省岱山縣的一個偏遠海島。所有家庭成員及其配偶都是島上的原始居民。我們檢查了8例患者(6例女性和2例男性),均表現(xiàn)為出生時有正常的頭發(fā),脫發(fā)開始于生后約1～3個月,并逐漸進展加重。最終出現(xiàn)頭發(fā)、體毛、腋毛和陰毛稀疏,但睫毛、眉毛正常。2例男性患者胡須均正常。皮膚鏡檢查未發(fā)現(xiàn)毛干特征性異常。所有患者全身皮膚、指趾甲、牙齒和眼睛均未發(fā)現(xiàn)異常。患者的整體精神運動發(fā)育正常。該家系基因分析顯示APCDD1基因出現(xiàn)C. 26T>G突變。而RPL21、SNRPE基因和CDSN基因未發(fā)現(xiàn)任何變異,屬于少毛癥1型。

2000年有學(xué)者首次對1個3代的意大利HHS家系進行了全基因組連鎖分析,定位突變位點位于18p11.32-p11.23［9］。2010年對2個巴基斯坦HHS家系進行遺傳分析,定位了18p11.22的APCDD1基因出現(xiàn)1個雜合錯義突變(C. 26T>G,L9R)［8］。隨后在中國人群中又報道了1個具有該雜合突變的家系［10］,此次為世界范圍內(nèi)報道的第5個,國內(nèi)第2個具有該雜合突變的家系,表明此錯義突變可能是一個熱點突變位點。

目前研究認為APCDD1是一種分類限制性基因,在包括小鼠、青蛙、斑馬魚和雞在內(nèi)的多種生物中抑制BMP和Wnt細胞信號通路［11］。它編碼一種具有新的蛋白結(jié)構(gòu)域的雙功能蛋白,大量表達于毛囊、牙齒、神經(jīng)系統(tǒng)［12,13］,該蛋白結(jié)構(gòu)域可與Wnt和BMP受體結(jié)合并阻斷其下游信號傳導(dǎo)。

HHS的研究發(fā)現(xiàn)APCDD1在體外可以與WNT3A和LRP5相互作用,以細胞自主方式,在β-連環(huán)蛋白上游抑制Wnt信號傳導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)野生型APCDD1蛋白定位于細胞膜,而突變的APCDD1(L9R)蛋白保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。推測突變的APCDD1(L9R)通過干擾APCDD1蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜的翻譯過程,以顯性遺傳負向調(diào)節(jié)方式發(fā)揮抑制野生型APCDD1蛋白的穩(wěn)定性和膜定位,從而導(dǎo)致毛囊微型化［8］。并可能導(dǎo)致毛囊隆突處干細胞庫的耗竭。

與國內(nèi)首次報道的家系相比,HHS患者的臨床表型并不完全一致。首次報道的家系中,大多數(shù)患者脫發(fā)始于出生后4個月,在15～20歲后頭發(fā)完全脫落,患者眉毛、睫毛也出現(xiàn)稀疏［10］。而此次報道的家系中,脫發(fā)開始更早,始于生后1～3個月,且沒有患者出現(xiàn)頭發(fā)完全脫落,2例男性個體只表現(xiàn)出輕至中度的頭發(fā)稀疏。所有患者眉毛、睫毛均正常。兩家系均表現(xiàn)為男性胡須正常。這些臨床特征的異同,說明HHS的臨床表型具有很大的多樣性,需要不斷發(fā)現(xiàn)與總結(jié),分析其與基因型的相關(guān)性。

本病目前無特效藥物治療,既往主要給予外用米諾地爾、佩戴假發(fā)等治療。近年來有研究嘗試口服米諾地爾［14］、富血小板血漿局部注射聯(lián)合外用米諾地爾［15］治療全身型HHS,外用慶大霉素［16］治療局限頭皮型HHS?；疾€體及其家系成員可以接受必要的基因檢測和遺傳咨詢。本研究為HHS基因診斷和治療提供了實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。