甘露糖抑制貓尿路感染的功能研究

張若男，呂雷

（衛仕寵物營養研究院，安徽蕪湖 241200）

貓的尿路感染是指由細菌感染所引起的泌尿道炎癥性疾病，包括腎盂腎炎、膀胱炎和尿道炎等[1]。 尿路細菌感染會使尿液中銨離子濃度增加，促進礦物質鹽類析出形成結晶，從而形成尿路結石[2]。尿路感染與尿路結石是寵物貓多發疾病，伴有排尿困難、血尿等癥狀[3]。大腸桿菌（Escherichia coli）是最常見的誘發貓尿路感染的病原菌，對大腸桿菌具有抗菌活性的抗生素能夠有效控制貓尿路感染的發生[4]。 甘露糖是一種廣泛存在于自然界多種植物中的糖類，在哺乳動物血漿中的濃度為50～100 μM[5]。有研究表明，甘露糖可以代替抗生素用于治療人類的復發性尿路感染，發揮卓越的抗感染作用[6]。 西方國家也將甘露糖用作人類保健品，用以預防尿路感染，保護泌尿系統健康[7]。 鑒于甘露糖對人類尿路感染的預防和治療作用，本研究著眼于目前動物臨床上貓尿路感染疾病多發的情況，探究了不同濃度的甘露糖對貓尿路感染病原菌（大腸桿菌）增殖活性的影響，并以貓腎上皮細胞系（CRFK）為載體，探究了不同濃度的甘露糖對大腸桿菌感染的貓腎上皮細胞的保護作用，以期為貓尿路感染的治療和預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞系及菌株

貓腎上皮細胞（CRFK，PWE-CT001）購于大連美侖生物技術有限公司，大腸桿菌（HBJZ087）購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 材料與試劑

DMEM 高糖細胞培養基（MA0212-2）、細胞培養級PBS （MA0015-2）、 青霉素/鏈霉素滅菌溶液（MA0110-1）購于大連美侖生物技術有限公司，胎牛血清 （10100147） 購于 Gibico 公司， 氯化鈉（10019308）、甲醇（10014108）購于國藥集團化學試劑有限公司，EDTA（0.25%）-胰蛋白酶（40127ES60）購于上海翌圣生物科技有限公司，甘露糖（M2069）購于默克公司，改良吉姆薩染色液（C0131）購于碧云天生物。

1.3 主要儀器

主要儀器設備見表1。

表1 主要儀器一覽表

1.4 試劑配制

細胞完全培養基： 在DMEM 高糖細胞培養基中添加10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素滅菌溶液。LB 液體細菌培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，加純凈水定容至1 L。

1.5 試驗分組與處理

1.5.1 大腸桿菌增殖試驗。 將大腸桿菌接種至LB 液體培養基中，設置如下分組。 對照組：不含甘露糖的LB 培養基；5 mM 甘露糖處理組：含5 mM 甘露糖的LB 培養基；10 mM 甘露糖處理組：含10 mM 甘露糖的LB 培養基。 將上述3 組大腸桿菌培養液置于臥式光照振蕩細菌培養箱內，37 ℃、250 r/min 培養16 h。 重復上述試驗3 次。

1.5.2 大腸桿菌感染試驗。 將CRFK 細胞接種于6 孔板中，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。 待細胞生長狀態良好時，將培養基更換為不含抗生素的細胞培養基并設置如下分組。 對照組：細胞培養基正常培養；大腸桿菌感染組:細胞培養基中加入大腸桿菌（OD600=0.5）；5 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組：培養基中含5 mM 甘露糖， 加入大腸桿菌攻毒1 h（OD600=0.5）；10 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組：培養基中含10 mM 甘露糖， 加入大腸桿菌攻毒1 h（OD600=0.5）。 重復上述試驗3 次。

1.6 試驗結果檢測

1.6.1 大腸桿菌增殖試驗。 將培養16 h 后的各組大腸桿菌培養液充分搖勻，分別取100 μL 置于96 孔板中，通過酶標儀檢測OD600值以反映菌液濃度。

1.6.2 大腸桿菌感染試驗。CRFK 細胞培養過程中，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝細胞的生長狀態。 對細胞進行大腸桿感染菌后，使用PBS 清洗3 遍，加入甲醇固定15 min， 然后使用改良吉姆薩染色液染色30 min 并清洗干凈，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝細胞形態與大腸桿菌感染情況， 最后使用Image J 軟件對上述拍攝圖片中的大腸桿菌數目與細胞數目進行統計，通過大腸桿菌數/CRFK 細胞數的比值來反映大腸桿菌感染情況。

1.7 數據統計與分析

采用GraphPad Prism 8 統計學軟件對試驗數據進行統計分析，試驗數據以“平均值±標準誤”表示；采用單因素方差分析對各組結果進行差異顯著性分析，***表示P<0.001，****表示P<0.000 1。

2 結果與分析

2.1 甘露糖對大腸桿菌增殖的影響

如圖1 所示，經過16 h 的搖菌培養后，相比于對照組，5 mM 甘露糖處理組和10 mM 甘露糖處理組的大腸桿菌菌液濃度均極顯著降低（P<0.001），表明甘露糖對大腸桿菌的增殖具有抑制作用。

圖1 甘露糖對大腸桿菌增殖的影響

2.2 甘露糖對大腸桿菌感染的CRFK 細胞的影響

如圖2 和圖3 所示， 未受大腸桿菌感染的CRFK細胞生長狀態良好，但經過1 h 的感染試驗，與對照組相比，大腸桿菌感染組的細胞發生了明顯的細菌感染。 如圖4 所示，5 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組和10 mM 甘露糖處理-大腸桿菌感染組的細胞被細菌感染的程度極顯著降低（P<0.000 1），其中10 mM甘露糖的效果更佳，表明甘露糖能夠極顯著抑制大腸桿菌對CRFK 細胞的感染（P<0.000 1）。

圖2 未受感染的CRFK 細胞的生長狀態

圖3 大腸桿菌對CRFK 細胞的感染

圖4 大腸桿菌數/CRFK 細胞數

3 討論

尿路感染與結石疾病不僅給貓帶來排尿障礙與疼痛，也會嚴重影響貓的精神狀態與食欲，導致其免疫力下降引發更嚴重的疾病[8]。 動物臨床上對于貓尿路感染與尿石癥的治療主要是通過抗感染藥物治療和溶解療法，對于病癥嚴重者會采用手術治療[9-10]。 雖然動物臨床上對于貓尿路感染與尿石癥已經有了較完善的治療策略，但是在此過程中貓仍無法避免疾病帶來的痛苦與治療的恐懼，因此預防該類疾病的發生能夠改善寵物貓的生存質量。

甘露糖在維護人類泌尿系統健康方面的作用已經獲得了認可[6-7]。本研究通過試驗探究了甘露糖在貓泌尿系統健康中的潛在作用，發現甘露糖能夠抑制貓尿路感染的病原菌——大腸桿菌的增殖，并抑制大腸桿菌對貓腎上皮細胞的感染。 在小鼠體內的試驗表明，以20%（m/V）的甘露糖水溶液作為飲用水，不會干擾實驗小鼠的正常生長發育[11]，這表明甘露糖對動物具有較高的安全性。 因此，甘露糖有望作為貓的食品添加劑或保健品，用以預防尿路感染，保持泌尿系統健康。另外，蔓越莓富含甘露糖與多種維生素。蔓越莓提取物能夠抑制人類尿路上皮細胞的感染[12]，同時蔓越莓提取物與甘露糖聯合應用能夠促進抗生素對急性尿路感染治療的敏感性[13]。 因此使用甘露糖作為食品添加劑有望對保持寵物貓泌尿系統健康產生一定的積極作用。