水源性致病微生物檢測中水樣前處理方法研究進展

吳 妍,張 曉,張 良,張 嵐

(中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所,傳染病溯源預警與智能決策全國重點實驗室, 北京 100050)

水是人類賴以生存的物質,但水中存在的各類污染源會損害人和其他動物的健康[1]。同時,水也是傳染病傳播流行的重要途徑之一。研究[2]表明,水中的微生物尤其是致病微生物是介水傳染病傳播的重要因素,主要包括細菌(霍亂弧菌、大腸埃希氏菌、彎曲桿菌和沙門菌等)、病毒(諾如病毒、腸道病毒、甲型肝炎病毒和輪狀病毒等)和原蟲(隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、溶組織內阿米巴蟲和圓孢子蟲等)。根據美國疾病預防控制中心疫情報告系統的數據,美國在1971年—2020年因飲用水中致病微生物(包括14種細菌、3種病毒和5種原蟲)污染共引起675起疫情,累計造成497 140人患病,276人死亡[3]。歷史上,霍亂弧菌曾引發多次世界范圍內的霍亂大流行[4-5];由沙門菌、志賀菌、大腸埃希氏菌等引起的細菌性腹瀉在發展中國家也十分常見[6-7];此外,過去各國研究者對軍團菌的研究都聚焦在噴泉水和空調冷卻水上,但近年來飲用水系統被軍團菌污染的事件也多有發生[8-10],2020年美國疾病預防控制中心辦公樓因在供水系統中發現軍團菌而被封閉[11]。因此,通過水質檢測對環境水體及飲用水中的致病微生物開展風險排查至關重要。

目前,水中致病微生物的標準檢測方法基本都基于培養法進行檢測[12-13]。但是某些因素可能會導致培養法細胞計數不完全,如微生物受到非致命性的傷害、微生物不可培養、生長溫度不適宜、生長周期不滿足、超過非自養的存在時間等[14-15]。近年來,國內外基于不同的檢測原理研發了多種更加便捷快速的檢測技術,如環介導等溫擴增技術(LAMP)[16]、基于三磷酸腺苷(ATP)的生物熒光檢測[17]、熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)[18-19]等。其中,分子生物學技術因具有高特異性和快速檢測的特點而逐漸得到廣泛應用,這些方法可快速對多種致病微生物進行高通量檢測,但在水體中的應用主要受限于3個因素:(1)水體中致病微生物存在水平較低;(2)存在抑制分子生物技術(如PCR)的干擾物質(如鹽度、腐植酸);(3)游離核酸(死細胞釋放的核酸)的持久性較好,導致在隨后的分子檢測方法中出現假陽性信號。因此,為了對水源性致病微生物進行更為準確靈敏的分析,采取適宜的前處理方法,對其進行有效地富集和凈化是非常有必要的。目前,國內外僅對水體中腸道病毒的富集濃縮方法有相關報道[20-21],但對致病微生物富集濃縮方法相關研究進展的總結分析較少。本文總結了水體致病微生物前處理方法的最新研究進展,分析了不同方法的優缺點和應用特點,以期為致病微生物高效便捷的方法研究與應用提供理論基礎和科學依據。

1 富集培養法

富集培養法是采用培養的方法對水樣中目標微生物進行增殖,以達到富集的目的。根據微生物呼吸類型,富集培養法可分為好氧培養與厭氧培養。但是大多數微生物(大多數細菌、霉菌、放線菌等)需要有氧條件下進行培養,培養的方法主要有:(1)固體培養法——在培養基表面(如斜面與平板表面)完成微生物增殖培養;(2)液體培養法——把微生物接種到液體培養基中進行增殖培養[22]。Wang等[23]開發了經過10～24 h培養后用PCR檢測水中大腸埃希氏菌和腸球菌的方法,檢出限可達到0.2 MPN/mL。Strakova等[24]通過一種基于離心、細菌運動和選擇性培養條件的新型培養方法,對廢水和地表水中的耐熱彎曲桿菌進行分離,在44%的樣品中檢出彎曲桿菌陽性。從現有的研究[25-27]來看,富集培養法在致病菌的富集濃縮中應用較多,對病毒和原蟲的富集濃縮常采用的是雞胚及雞胚器官培養和細胞培養的體外培養模型,但這種方法目前主要應用于藥物的開發,在水體中的應用較少。

鑒于細菌培養過程中大部分選擇性培養基只能培養特定的目標菌株,無法滿足多種致病菌高通量檢測的需求,開發多重選擇性培養液以實現多種致病菌的同時培養,目前成為了一個新的研究熱點。Suo等[28]開發了一種可以同時培養大腸埃希氏菌O157:H7、沙門菌屬和單核細胞增生李斯特氏菌3種致病菌的SEL (Salmonella,E.coliO157:H7 andL.monocytogenes)培養液,在1～100 CFU/mL接種濃度下,3種目標菌株經過1 h非選擇性恢復期,在37 ℃選擇性培養20 h后均可富集到1×108～1×109CFU/mL。Qu等[29]開發了一種可以同時培養沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7和單核細胞增生李斯特菌的SSEL (Salmonella,Staphylococcusaureus,E.coliO157:H7 andL.monocytogenes)培養液,在10～100 CFU/mL接種濃度下,4種目標菌體37 ℃培養18 h后均可富集到1×105CFU/mL。

富集培養法的優點是可以選擇性培養目標菌株,同時可排除死菌和其他雜質的干擾(如非腐殖質生物、腐殖質等),但該方法培養過程耗時且只適用于可培養的細菌或真菌的富集,限制了其在致病微生物檢測前處理過程中的研究和應用。

2 離心法

基于離心的前處理方法是利用離心力將大小、形狀、密度和介質黏度不同的顆粒從液體介質中分離出來,是分子生物學實驗室中最常用的技術之一[30],主要包括直接離心法和密度梯度離心法。

2.1 直接離心法

直接離心法是直接對水中的微生物進行離心,通過將大部分微生物沉降于管底來達到分離及富集濃縮的目的。根據目標微生物的大小不同可選擇不同的離心條件。原蟲體積較大,直徑>3 μm,選用的離心力一般為500～2 000g;細菌直徑一般為0.5～10 μm,常用的離心力為3 000～12 000g;病毒直徑一般為0.01～0.1 μm,常用的離心力為90 800～171 000g[31]。Maal等[32]以8 000g離心10 min后提取DNA的方法對伊朗伊斯法罕南部污水處理廠的進水水樣進行大腸埃希氏菌菌株的分離鑒定。《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分:微生物指標》(GB/T 5750.12—2023)[33]采用Filta-Max Xpress快速方法對飲用水中賈第鞭毛蟲/隱孢子蟲進行測定時,采用的分離條件是2 000g離心15 min。Ahmed等[34]對澳大利亞布里斯班某城市污水處理廠的進水水樣進行小鼠肝炎病毒測定時采用的分離條件是以100 000g在4 ℃下離心1 h,之后提取RNA并結合實時qPCR(RT-qPCR)完成檢測,回收率為33.5%±12.1%。

直接離心法的優點主要體現在以下幾個方面:①方法成本只涉及離心機的初始投資,使用中不需要化學試劑或其他昂貴的消耗品;②速度快,可以在相對較短的時間內完成大體積水樣的處理;③方法操作簡單、技術要求低,操作過程中不會引入其他物質、試劑,對目標微生物影響較小。然而,直接離心法也存在不足之處:①在富集目標微生物的同時會對其他顆粒進行富集,特別是對于渾濁度高的水樣,容易對后續操作(如核酸提取、PCR檢測等)造成影響;②離心后傾倒上清液時易造成目標微生物損失。

2.2 密度梯度離心法

密度梯度離心法是用一定的惰性介質(蔗糖、甘油等)在離心管內形成連續或不連續的密度梯度,根據微生物在密度梯度液中的比重不同,通過離心力的作用使目標微生物分離的一種技術。Garrison等[35]在弗吉尼亞州諾福克的拉斐特河和海灣流淌的水中加入大腸埃希氏菌和鞭毛蟲后,采用蔗糖密度梯度離心法實現了對兩種微生物的富集。Chesnot等[36]采用不同惰性介質的密度梯度離心法實現了渾濁水樣中隱孢子蟲卵囊的富集,已發布的GB/T 5750.12—2023中兩蟲檢測也新增了密度梯度法。Hinzke等[37]使用蔗糖密度梯度離心法根據微生物大小從海水中富集了細菌共生體。

密度梯度離心法的優點是:①分離效果好,可一次獲得雜質較少的目標微生物;②適用范圍廣,既能分離沉降系數不同的顆粒,又能分離密度不同的顆粒。該法存在的局限性是:①成本昂貴;②需要制備惰性介質溶液;③操作復雜,不易掌握。

3 過濾法

過濾技術是以壓力作為推動力的一種膜分離技術,膜孔徑為(<2 nm)～(>20 μm)。其分離機理主要有兩種:(1)機械篩分,通過膜截留比膜孔徑大或與其孔徑相當的微生物顆粒;(2)吸附截留,當微生物穿過膜表面進入膜內部時,利用膜自身的物理化學性質和靜電引力使微生物沉積在膜孔側壁或膜內部基質上[38]。根據膜孔徑大小,過濾技術可被分為微濾、超濾、納濾和反滲透,在微生物前處理過程中主要采用微濾和超濾技術。

3.1 微濾法

3.1.1 傳統微濾法

微濾是在壓力驅動下利用孔徑為0.05～10 μm的微孔膜截留直徑在0.1～10 μm的顆粒,多用于懸浮物、細菌及大尺寸膠體的膜分離過程[39]。Shrestha等[40]采用0.40 μm聚碳酸酯過濾器和qPCR檢測技術相結合的方法對芝加哥8處海灘水樣中的腸球菌和大腸埃希氏菌進行了檢測。Haugland等[41]用0.40 μm孔徑的聚碳酸酯過濾器對美國密歇根州休閑水域水樣進行過濾后,分別通過培養和qPCR技術對大腸埃希氏菌進行了檢測。Wolf-Baca等[42]用0.20 μm孔徑的混合纖維素酯膜過濾器過濾水樣,提取DNA后用qPCR檢測到了熱水中的嗜肺軍團菌和大腸埃希氏菌。在過去的研究中,常用的濾膜主要包括混合纖維素酯膜、醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜和聚碳酸酯膜,表1描述了不同材質和孔徑的微孔濾膜的截留效果,每種濾膜做5次平行試驗。根據表1所示結果,0.22 μm孔徑的混合纖維素酯膜截留效果最好。

表1 4種濾膜截留效果統計分析[43]

3.1.2 改性微濾法

傳統的微濾技術因為膜孔徑較大,只適用于去除體積較大的致病微生物(如致病菌、原蟲),不適用于去除病毒。基于吸附-洗脫原理利用電正性或電負性膜則可以通過電荷相互作用將病毒顆粒吸附到過濾介質中,然后通過調整溶液的pH將病毒洗脫下來。該方法已被廣泛用于富集來自水環境的各種病毒[44-45]。

(1)電正性膜過濾法

電正性膜過濾法是依賴水中病毒顆粒固有的負電荷來實現病毒的富集。電正性膜過濾器主要包括玻璃/纖維素過濾器(1MDS)和納米氧化鋁/玻璃過濾器(NanoCeram)。Soto-Beltran等[46]分別采用NanoCeram和1MDS從處理的污水中回收脊髓灰質炎病毒,NanoCeram方法的病毒回收率為57%,1MDS方法的病毒回收率為23%。Ikner等[47]采用NanoCeram過濾器與超濾相結合的方法對水中的埃可病毒1、柯薩奇病毒B5、脊髓灰質炎病毒1、腺病毒2和大腸埃希氏菌噬菌體MS2進行富集,回收率分別為83%、77%、66%、14%和56%。電正性過濾器的價格昂貴,其優點是操作簡便,無需進行預處理,且濾芯的選擇性多,在大多數情況下能夠過濾大量水體(>1 000 L)而不會堵塞,渾濁度較高的水樣除外。

(2)電負性膜過濾法

病毒在天然水體中通常帶負電,但在陽離子如Mg2+和Al3+存在或酸性條件下,其凈電荷變為正電荷時,可利用靜電作用將病毒吸附在電負性膜上,隨后通過洗脫獲得病毒顆粒[48]。Haramoto等[49]開發了一種結合Al3+或Mg2+使用電負性過濾器的方法,并成功從250～500 mL 超純水、瓶裝水、自來水、河水和池塘水中富集人類諾如病毒,回收率分別為186%、167%、80%、15%和39%。Victoria等[50]使用電負性膜過濾與qPCR檢測相結合的方法,實現了在不同環境水體中對人類星狀病毒和諾如病毒的富集。電負性膜過濾法的優點在于其價格低廉;然而該方法在過濾前需要對水樣或過濾器進行預處理,不適用于大體積水樣的過濾和常規監測。

3.1.3 小結

微濾法可根據不同目標微生物選擇不同類型的濾膜以實現非渾濁水體的快速富集。傳統微濾法適用于原蟲、致病菌的富集,但其存在膜堵塞的風險,不能直接用于大體積、渾濁水樣中微生物的分離,在過濾前可使用大孔徑濾膜或紗布對渾濁水樣進行預過濾以去除粗顆粒,避免堵塞。改性微濾法適用于水中病毒的富集,其中電正性膜過濾價格昂貴,但可直接用于大體積水樣的過濾,電負性膜過濾價格低廉,但其在過濾前需對水樣或過濾器進行預處理。

3.2 超濾法

超濾是一種基于粒度排斥原理實現在大體積水樣中同時富集多種致病微生物的前處理技術,主要包括死端超濾和錯流超濾兩種方式[51]。該方法于20世紀70年代作為一種富集水中病毒的方法首次被提出[52-53]。超濾膜的平均孔徑在0.001～1.000 μm[54]。在過去10年里,已有大量研究[55-57]證明超濾是一種富集飲用水和水源水中致病微生物的強大技術。

3.2.1 死端超濾法

死端超濾是將水置于膜的上游,在壓力差的推動下使大于膜孔的致病微生物被膜截留的一種方法。Mull等[58]利用死端超濾法對40 L平均渾濁度為18 NTU的湖水中的多種微生物進行富集,其中,大腸埃希氏菌和腸球菌的平均回收率分別為81%和85%。Inkinen等[59]對芬蘭5個不同的飲用水分配系統的108個水樣采用死端超濾法濃縮后再進行核酸提取,使用PCR檢測到古菌群落的存在。Pascual-Benito等[60]采用死端超濾法對西班牙加泰羅尼亞兩個供水中心的水樣進行糞便指示生物(FIO)和病原體富集,平均回收率為43.8%±17.5%。死端超濾法可以對大體積水樣中的致病微生物進行回收,但是隨著過濾時間的延長,被截留物質將在膜表面富集,過濾阻力增加,在操作壓力不變的情況下,膜的滲透速率將下降。因此,死端超濾法只能間歇進行,必須周期性地清除膜表面的污染物層或更換膜。

3.2.2 錯流超濾法

錯流超濾是指在錯流過濾過程中,膜表面同時受到兩個力的作用,即垂直于膜表面的力與平行于膜表面的力[61]。與死端超濾法相比,錯流超濾法膜表面污染相對較輕,膜通量更穩定,可以實現過濾過程的連續運行。Gibson等[62]為了對加納南部農村社區飲用水源的微生物質量進行更廣泛的評估,采用了錯流超濾和qPCR相結合的方法對100 L地下水、飲用水和地表水樣品進行測定,地下水和地表水中大腸埃希氏菌的回收率分別為34%～67%和(<1%)～(>120%)。Kahler等[63]使用錯流超濾法從地下水和地表水中富集了大腸埃希氏菌、產氣莢膜梭菌、微小隱孢子蟲、埃可病毒以及噬菌體,結果表明5種腸道致病微生物的平均超濾回收率為66%～95%。Ryu等[64]采用錯流超濾和qPCR相結合的方法對德克薩斯州3個匿名廢水處理廠的94個水樣中的細菌(總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌)、原蟲(隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲)和病毒(男性特異性噬菌體、體細胞噬菌體和人腺病毒)進行檢測,該方法檢出限為0.004 PFU/mL。

3.2.3 小結

超濾法的優點主要是其對細菌細胞壓力小,從而有利于保持細胞完整狀態。同時,盡管超濾膜的孔徑小于微濾膜孔徑,但錯流超濾法在運行時平行于膜面的切向力可以把膜面的截留物沖刷掉,不易造成過濾器堵塞。因此,該方法在處理低質量水方面具有潛在的應用價值。該方法的局限性主要在于超濾過程中水體基質的諸多組分易和目標微生物一同被富集,影響后續檢測,如腐植酸和富里酸會抑制后續 PCR的檢測[65]。

4 磁性分離法

磁性分離是以磁性或可磁化的材料作為吸附劑的一種分離富集技術。大多數應用于分離的磁性材料具有超順磁性,即在通常情況下沒有磁力,在外加磁場下可表現出磁性。在沒有磁場的情況下可以充分地分散在溶液中,與目標物結合,之后在外加磁場下聚集于容器一側,通過棄去溶液和重復洗滌來最大限度地去除抑制物。磁性材料只是載體,只有對磁性納米材料(magnetic nanoparticles,MNPs)進行表面修飾,使其具有抗體、抗生素(萬古霉素、達托霉素等)和化合物等識別基團才能捕獲目標微生物。

4.1 免疫磁分離法

免疫磁分離是指用抗體修飾MNPs,基于抗體-抗原相互作用從水體中選擇性捕獲目標微生物。Guven等[66]用IgE標記的免疫磁珠分離水樣中的大腸埃希氏菌,結合免疫分析技術進行檢測,檢出限為8 CFU/mL。Huy等[67]用蛋白A偶聯殼聚糖修飾的Fe3O4磁性顆粒結合IgG抗體從濃度低至10 CFU/mL水樣中分離出了霍亂弧菌。我國施行的《生活飲用水標準檢驗方法 第12部分:微生物指標》(GB/T 5750.12—2023)規定采用免疫磁分離熒光抗體法測定生活飲用水及其水源水中的賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊。Villamizar-Gallardo等[68]使用抗輪狀病毒單克隆抗體功能化氟MNPs實現了對水中輪狀病毒的富集。

4.2 基于抗生素修飾的磁性分離法

一些抗菌物質能夠抗菌是因為能與致病菌表面的一些生物結構相互結合,利用這一特點將其與磁性粒子結合可以起到捕獲細菌的作用。Meng等[69]用萬古霉素修飾的MNPs捕獲水、牛奶和果汁飲料中的金黃色葡萄球菌,結合流式細胞儀,檢出限為33 CFU/mL。Ding等[70]用抗菌肽功能化MNPs在較低質量濃度下(0.1 mg/mL)實現了對致病性革蘭氏陰性桿菌的半選擇性捕獲,在較高質量濃度下(0.5 mg/mL)實現了對自來水和娛樂用水中大腸埃希氏菌的高效捕獲,捕獲效率大于97%。

4.3 其他

除了基于抗體和抗生素修飾的分離磁珠之外,還有一些其他經過化合物改性的磁珠被用于致病菌、病毒分離。Zhan等[71]制備了一種新型的胺功能化磁性Fe3O4-SiO2-NH2納米粒子,可捕獲水中的病毒(脊髓灰質炎病毒1)和致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7、銅綠假單胞菌、沙門菌和枯草桿菌),回收率為92%～96.3%。Huang等[72]報道了用胺基修飾的硅包Fe3O4MNPs分離水和飲料中的大腸埃希氏菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌等多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌,平均回收率達到了88.5%～99.1%。Bohara等[73]用功能化鐵酸鈷納米顆粒基于疏水作用捕獲水樣中的革蘭氏陰性菌(大腸埃希氏菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌),平均回收率分別為65%和95%。雖然這些化合物修飾的MNPs無法特異性地區分某個特定的種屬或者菌株,但這種廣泛性是抗體和抗生素等識別片段無法比擬的,因此,這類磁珠的研究與開發也會是未來的熱點方向之一。

以上各種磁性分離方法的優缺點匯總如表2所示。總的來說,磁性分離在致病菌和病毒前處理方面具有很大優勢,可以快速有效地去除干擾物的同時富集目標微生物,無論是與分子檢測方法還是其他檢測方法結合都具有巨大的潛力,但局限在于其在水中原蟲的富集應用較少,此外,影響其穩定性因素多。

表2 各種磁性分離方法的優缺點匯總

5 討論

近年來,由水源性致病微生物引發的水媒傳染病吸引了各國研究者的注意,水體受到致病微生物污染的相關報道顯示,提高水體中致病微生物的檢測能力對水源性疫情暴發早期預警具有積極作用。然而,一般情況下環境水體中致病微生物含量較低,且環境水體基質復雜,因此,為了保證對水源性致病微生物靈敏、準確的檢測效果,必須進行充分的樣品前處理以富集水體中的目標微生物。

本文綜述了近年來各種水體中致病微生物前處理方法的研究進展,為選擇富集目標微生物的最佳方法提供依據。以上各種方法的優缺點及適用范圍如表3所示。(1)離心法和過濾法是根據微生物的物理特性,非特異性地富集致病微生物,適用范圍較廣泛。直接離心法和密度梯度離心法均適用于小體積水體中致病微生物的富集;對于過濾法,傳統微濾和改性微濾分別適用于非渾濁水樣中致病菌、原蟲和病毒的富集,超濾法適用于大體積水體中致病菌、原蟲、病毒的同時富集。(2)富集培養法和磁性分離法是根據微生物的生物特性,特異性地富集致病微生物。其中富集培養法適用于水體中特定可培養致病菌的富集;根據修飾材料的不同,磁性分離法可分為免疫磁分離和基于抗生素/化合物修飾的磁性分離等,免疫磁分離法適用于小體積水體中特定目標微生物的富集,基于抗生素修飾的磁性分離法適用于小體積水體中多種致病菌的富集,基于化合物修飾的磁分離法則適用于小體積水體中多種致病菌、病毒的富集。

表3 水體致病微生物前處理方法的優缺點及其適用范圍

6 結論

(1)水體致病微生物污染可對人類和動物造成危害,引發介水傳染病,而水體中致病微生物濃度低、基質復雜,對水樣進行充分的前處理可以提高水體中致病微生物的檢測能力。

(2)從現有研究來看,常用的前處理方法主要包括富集培養法、離心法、過濾法、磁性分離法等。

(3)各種水樣前處理方法各有特點,在應用過程中可根據不同方法的優缺點和適用范圍針對性進行選擇。

(4)基于現有前處理方法的不足,未來研發的重點應該是在最大可能排除雜質干擾的基礎上努力減少前處理過程中目標微生物的損失,如開發水體雜質去除方法、開展水體中致病微生物的二次富集等,為實現水源性致病微生物高效、快速的檢測及水源性疫情暴發早期預警提供基礎。